全基因组外显子测序 全基因组外显子测序技能在遗传性纤维蛋白原反常家系致病基因的克隆判定中的使用

刘晓娣　张新友　宋通微　洪澄英

[摘要]意图研讨选用全基因组外显子测序技能在遗传性纤维蛋白原反常家系致病基因判定中的使用价值。办法搜集12例遗传性纤维蛋白原反常患者及其间心家庭成员外周血检测凝血方针，并提取其基因组DNA进行全基因组外显子测序，剖析测序成果，评论遗传性纤维蛋白原反常的分子机制。成果全基因组外显子测序成果显现：先证者A1、A4以及B2均为FGA基因g，1233G>A骤变，A1的妹妹、A4的父亲以及B2的母亲均带着有相同的骤变；A2、A7、B4和B5均为FGG基因g，10819G>A骤变，家系成员中A2的母亲和外婆、A7的姐姐和女儿、B4的母亲和B5的母亲均带着有相同的骤变；A3、A5、A6、B1和B3及其相关亲属共10例带着有FGB基因g，9692A>G骤变。先证者及家系首要成员中发作Fg基因骤变的成员APTT、PT和TT均显着延伸，但Fg活性显着下降。定论遗传性纤维蛋白原反常可由多种Fg基因外显子骤变导致，FGB和FGG外显子骤变较为常见。

[要害词]遗传性纤维蛋白原反常；全基因组外显子测序；家系致病基因；基因骤变

[中图分类号]R554.5

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2016）03-33-04

纤维蛋白原（Fgrinogen，Fg）可以在凝血酶效果下润饰成为纤维蛋白，在止血过程中发挥重要的生理效果，一起又可激活纤溶体系避免血栓的构成，Fg在团体出血与止血平衡中发挥重要的效果。遗传性反常纤维蛋白原血症（inheriteddvsfgrinogenemia）是人群中稀有的一种常染色体杂合显性遗传病，纯合显性遗传者罕见，该病发病率低，患者大都仅表现为细微隐匿性症状。Fg基因较为杂乱，从分子发病机制上方能很好地研讨和确诊遗传性反常纤维蛋白原血症。本研讨于2015年1～8月针对我院搜集的遗传性纤维蛋白原反常患者及其具有直接血缘关系的亲属和正常健康者，进行表型和基因剖析，旨在从功用上评论遗传性纤维蛋白原反常的分子发病机制。

1.材料与办法

1.1一般材料

选取遗传性纤维蛋白原反常患者及其具有直接血缘关系的亲属和正常健康者参加本研讨。其间，已确诊的该疾病2个家系先证者合计12例，A家系7例，B家系5例先证者家系中的中心家系内成员共26例，A家系15例，B家系11例；正常健康者200例。12例先证者中有5例因消瘦原因就诊，生化查看表现为凝血酶原时刻（PT）及凝血酶时刻（TT）延伸，活化部分凝血时刻（Am）正常，纤维蛋白原（Fg）活性显着下降；3例先证者无临床症状，但易发作瘀斑、创伤愈合推迟，有自发流产史；4例先证者表现为经期经血过多，凝血较差，术前查看为TT显着延伸，Fg活性下降。一切先证者往常均无自发出血、血栓病史，心脑、肝、肾功用均正常，地点家系中无近亲结婚史，一切成员亦无自发出血、血栓病史，心脑、肝、肾功用均正常。

一切患者在搜集血液等样本和个人信息时均知情赞同并签字，本研讨经我院道德委员会赞同赞同进行。

1.2研讨办法

1.2.1样本搜集及处理在知情赞同的状况下，搜集患者、家系成员静脉血，以0.109mol/L枸橼酸钠1：9抗凝，4℃下1500rpm离心15min，将血浆-进行分装于洁净冻存管中进行符号，冷冻于70℃超低温冰箱保存。提取一切研讨对外周血细胞中基因组DNA进行外显子测序，-80%保存备用。

1.2.2家系基因剖析经过QIAGEN公司出产的QIAamp DNA Blood Mini Kit提取从搜集的血浆样本中提取研讨方针的基因组DNA作为下步基因扩增的模板。家系基因剖析选用测序办法找寻骤变位点，测序办法为全基因组外显子测序。

依据美国国家生物技能信息中心（NationalCenter of Biotechnology Information，NCBI）基因库中发布的Fg基因序列（FGB ID：2244；FGA ID：2243；FGG ID：2266），使用Primer Premier 5.0软件设计23对引物以掩盖Fg基因的24个外显子区域及其启动子序列，其间FGA引物5对，FGB引物8对，GGG引物10对。将提取得到的DNA随机打断，将片段化的DNA分子在酶的效果下补齐随机打断构成的黏性结尾而成为平结尾，衔接接头，经过NimbleGen外显子序列捕获芯片捕获方针外显子区域，检测其捕获功率；然后对捕获的方针片段进行PCR扩增，产品衔接后随机打断，结尾补平及加“A”碱基，衔接测序接头，PCR扩增并检测序文库的质量，最终使用illumina公司NextSeq 500测序仪进行测序。

PCR扩增反响体系为：上下游引物各1.5uL、模板DNA 2uL、dNTP混合物2uL、10×PCR反响缓冲液2.5uL、Taq DNA聚合酶0.2uL、无菌超纯水15.3uL，总体积25uL。PCR扩增条件为：95℃预变性30sec→95℃变性30sec→52～63℃退火30sec→72℃延伸45sec。

1.2.3表型剖析将搜集的研讨方针的外周血，以0.109mol/L枸橼酸钠1：9抗凝，4℃下3000rpm离心10min，取血浆检测凝血酶原时刻（PT）、活化的部分凝血活酶时刻（APTT）、凝血酶时刻（TT）、Fg活性。

2.成果

2.1家系基因剖析成果

家系A和B中的12例先证者纤维蛋白原基因剖析成果见表1，先证者A1、A4以及B2均为FGA基因第2外显子g，1233G>A骤变，A1的妹妹、A4的父亲以及B2的母亲均带着有相同的骤变；A2、A7、B4和B5均为FGG基因第8外显子g，10819G>A骤变，家系成员中A2的母亲和外婆、A7的姐姐和女儿、B4的母亲和B5的母亲均带着有相同的骤变；A3、A5、A6、B1和B3及其相关亲属共10例带着有FGB第4外显子g.9692A>G骤变。家系其他成员及健康对照基因检测均未发现反常。见表1。

2.2先证者及首要家系成员表型检测成果

表2中为先证者及首要家系成员表型检测成果，可见一切先证者APTT、PT和TT等三项凝血方针均有显着延伸，但Fg活性显着下降。经全基因组外显子测序承认发作基因骤变的家系首要成员APqT、PT和TI"等三项凝血方针也存在显着延伸，Fg活性显着下降的现象。其他家系成员和健康者四项方针均正常。

3.评论

纤维蛋白原由3条同源多肽链Aα、Bβ、γ聚合而成的六聚物（AαBβ γ），这三条多肽链分别由FGA、FGB和FGG基因编码，且三个基因为同源基因，基因定坐落4q28-4q31约50kb的染色体区域内，按5→3方向依次为FGG、FGA和FGB。三个基因中的任何一个发作骤变均可导致纤维蛋白原呈现数量及功用上反常，研讨标明FGA基因骤变占一切纤维蛋白原基因骤变中的大都。纤维蛋白原反常对纤维蛋白肽开释、集合、安稳性、交联，纤溶均能发作影响。遗传性反常纤维蛋白原血症是因为纤维蛋白原基因发作骤变发作的一种纤维蛋白原结构和功用反常的遗传性疾病，常表现为APTT、PT和TT等凝血方针延伸、Fg活性下降等。现在，基因骤变检测是遗传性反常纤维蛋白原血症临床确诊的金规范，但在临床确诊时还需要剖析其临床表现、凝血功用方针和家系状况。

外显子序列发展人类基因组序列的缺乏1%，单包括有85%以上的人类基因信息，人类大都遗传疾病均是因为相应基因外显子区域发作骤变所造成的。全基因组外显子测序技能是近年来发展起来的用于寻觅人类基因致病基因及发病机制的一种办法，李斌等使用全外显子组测序技能发现了基因c.1735 1736insT框移骤变为Kallmann综合征为新的疑似致病性骤变。

本研讨中，先证者A1、A4以及B2均为FGA基因第2外显子g.1233G>A骤变，A1的妹妹、A4的父亲以及B2的母亲均带着有相同的骤变；A2、A7、B4和B5均为FGG基因第8外显子g.10819G>A骤变，家系成员中A2的母亲和外婆、A7的姐姐和女儿、B4的母亲和B5的母亲均带着有相同的骤变；A3、A5、A6、B1和B3及其相关亲属共10例带着有FGB基因第4外显子g.9692A>G骤变。先证者及家系首要成员中发作Fg基因骤变的成员APTT、PT和TT均显着延伸，但Fg活性显着下降。

FGA基因g.1233G>A骤变能导致Aα中的Arg35被His或许Cys代替，是纤维蛋白原反常中最常见的骤变，能使影响凝血酶对纤维蛋白原肽的开释，按捺纤维蛋白聚合。FGB基因g.9692A>G骤变可导致纤维蛋白原糖基之间可以经过彼此排挤力使纤维蛋白网状结构愈加安稳，然后调理纤维蛋白构成，糖基化影响纤维蛋白初限位的彼此交联和纤维集合，但因为这种改动没有影响到首要的集合位点，纤维蛋白未受到要害影响，患者多无临床表现。FGG基因g.10819G>A骤变常导致γ链中的Arg301发作变化。γArg301是纤维蛋白初纤维过程中D-D触摸面上的重要位点之一，关于纤维蛋白网状结构构成所必需的，该位点的骤变可以影响纤维蛋白正常结构和集合功用，大都骤变基因带着者无临床症状。

综上，遗传性纤维蛋白原反常可由多种Fg基因外显子骤变导致，FGB和FGG外显子骤变较为常见，这可能与地域有关。