中量骨痂,骨质疏松：补肾健脾中药复方对骨质疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表达的影响

龚辉松

[摘要]意图 剖析补肾健脾中药复方对骨质疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表达的影响。办法 挑选6月龄清洁级健康雌性SD大鼠60只，随机分为3组：模型组、西药组和中药组，每组20只。骨质疏松骨折模型成功后，中药组和西药组分别给予补肾健脾中药复方和阿伦磷酸钠混悬液灌服，模型组进行惯例培育，1个月后取各组骨折的骨痂，进行体外培育，各组骨痂给予对应含药血清进行培育。选用荧光定量PCR法检测各组CTGF、Osterix因子的表达。成果 在CTGF表达方面，中药组和西药组中的CTGF mRNA含量显着高于模型组，差异有统计学含义（P<0.05）；在Osterix表达方面，中药组和西药组中的Osterix mRNA含量显着高于模型组，差异有统计学含义（P<0.05），且中药组的Osterix mRNA含量高于西药组（P<0.05）。定论 补肾健脾中药复方能在必定程度上促进骨痂的成长，然后促进骨折愈合，为骨质疏松性骨折愈合的机制和防治办法供给了一种新的途径。

[关键词]补肾健脾中药；骨质疏松骨折；骨痂；结缔安排成长因子；Osterix

[中图分类号] R683 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（a）-0063-04

[Abstract]Objective To analyze the influence of Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen on CTGF and Osterix factor expression in callus of osteoporotic fracture.Methods 60 female SD rats of clean-class aged six-month were selected and they were randomly divided into 3 groups：model group，western medicine group and traditional Chinese medicine group （TCM group） （n=20）.After the success of the osteoporosis′ fracture model，TCM group was given Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen and the western medicine group was given sodium alendate suspension.The model group was given routine culture.After 1 month，the callus of each group was taken and cultured in vitro.The callus of each group was cultured with the corresponding serum.CTGF and Osterix expression in each group were detected by fluorescence quantitative PCR.Results The expression of CTGF mRNA in TCM group and western medicine group was significantly higher than that in model group （P<0.05）.Osterix mRNA level in TCM group and western medicine group were significantly higher than those in model group （P<0.05），and the content of Osterix mRNA in TCM group was higher than that in western medicine group （P<0.05）.Conclusion Chinese herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen can promote the growth of callus to a certain extent，thus promote fracture healing，and it provides the new way for the mechanism and prevention and treatment methods osteoporosis′fracture healing.

[Key words]Chinese herbal medicine of tonifying kidney and strengthening spleen；Osteoporosis fracture；Callus；Connective tissue growth factor；Osterix

骨質疏松症最严峻的并发症是骨质疏松性骨折，严峻影响患者的日子质量。骨质疏松性骨折是因为骨强度下降所构成的。现在已知的影响骨强度的要素首要有骨量、骨微结构、骨的几许形状、皮质骨厚度和多孔程度、骨安排构成材料的内涵功用等[1]。骨质疏松性骨折的防治已成为了全世界重视的课题。但是，现在国内外对骨质疏松性骨折愈合机制以及对骨质疏松性骨折部分骨痂的“质量”的研讨相对较少，且首要针对体内环境中的骨痂进行评论。本研讨通过树立骨质疏松性骨折模型及骨痂安排体外培育体系，运用中药血清药理学的研讨办法，模仿中药在体内效果于骨痂安排的形式，调查补肾健脾中药复方对体外环境中骨痂生物学特性的改动以及结缔安排成长因子（connective tissue growth factor，CTGF）、Osterix因子表达的影响，提醒补肾健脾中药复方对骨质疏松性骨折骨痂生物学特性影响的效果机制，为中医“肾主骨”理论供给试验依据。亦为研讨骨质疏松性骨折愈合的生理病理机制和医治办法供给一种新的思想形式。

1材料与办法

1.1试验动物

6月龄清洁级健康雌性SD大鼠60只，其体重为（260±30）g。随机分为3组：模型组、西药组和[l1]中药组；每组20只。一切动物均为广州中医药大学动物中心供给。

1.2试验药物

中药组选用补肾健脾中药复方灌服，药物的首要组成包含：黄芪12 g，补骨脂15 g，淫羊藿15 g，菟丝子12 g，肉苁蓉15 g，熟地15 g，白芍10 g等组成。依据临床用药剂量及新药研讨中动物用药剂量要求，该方的提取药物，含生药量1.65 g/ml。西药组选用阿伦磷酸钠片配制成0.055 mg/ml浓度的阿伦磷酸钠混悬液（杭州默沙东制药有限公司供给，国药准字J20080069）。

1.3含药血清的制备

每组中10只大鼠给予相应的药物接连灌胃2周，其间西药组和中药组以蒸馏水定容至上述所需浓度，每日灌胃1次，模型组给予正常饮食。终究1次给予动物灌胃后的2 h，对动物行心脏采血。取得的全血置于含EDTA抗凝试管中，5～10 min后，以3000 r/min离心15 min，汲取上清，加以灭活，抽滤除菌，放置-20℃冰箱保存。

1.4 动物造模

每组中别的10只作动物模型，选用10%水合氯醛溶液作麻醉，以0.33 ml/100 g腹腔打针，待5 min后，大鼠麻醉彻底，选用背侧入路行双侧卵巢摘除术以造模。3个月后，行骨密度查看，证明模型成功后，对各组麻醉，消毒右下肢，取膝内侧髌旁切口约1 cm，逐层别离切开，将髌骨及韧带向外侧推开，露出膝关节，委曲膝关节，露出髁间窝，钻入0.5 mm克氏针，至股骨转子下，做髓内固定，剪断克氏针，残端长度以不影响关节活动为度。运用骨折发作设备将股骨构成闭合性骨折[2-3]。

1.5给药办法

骨质疏松骨折的模型成功后，各组开端灌胃医治，灌胃给药容积为10 ml/kg，模型组灌服蒸馏水；西药组和中药组以蒸馏水定容至上述所需浓度，每日灌胃1次，医治时刻为1个月。

1.6骨痂的体外培育

摘取眼球取大鼠外周血3～4 ml，取血后处死，置于75%的乙醇浸泡15 min，置于无菌台上，切开皮肤及皮下，别离肌肉，露出骨折段，取出骨痂，PBS漂洗后放于Eppendorf管作备用。大鼠处死前24 h禁食。将新鲜骨痂标本切成1 mm×1 mm×1 mm巨细，通过两次含有青霉素及链霉素的PBS液漂洗后，放入培育板，加等量bGJB培育液，置于37℃，5%CO2中静置培育，24 h后换液，依据分组状况分别加用含药血清与bGJB培育液一起培育，1周后搜集标本进行相关目标检测。

1.7 目标的检测及成果的核算

选用荧光定量PCR检测各组骨痂中的CTGF 和 Osterix 的mRNA含量。运用引物和探针规划软件Primer 5.0，除了考虑引物、探针规划的通用准则外，此引物Tm值要求在58～60℃，探针Tm值在68～70℃，以确保探针特异性杂交。序列表见表1。

依照抽提的总RNA应立刻进行反转录：取2 μl RNA模板做逆转录反响，反转录反响程序：30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min；取1 μl反转录产品（cDNA）进行荧光定量PCR。依据实时荧光定量RT-PCR的原理，以β-actin基因mRNA的表达为内对照。ΔCt=Ct（意图基因）-Ct（β-actin），然后核算试验组各样本的ΔCt与对照组样本的ΔCt的差值，然后得到ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt（试验组）-ΔCt（对照组）。选用2-ΔΔCt进行核算。标明试验组测定基因的表达相关于对照组样本基因的表达的改动倍数，将2-ΔΔCt作为终究的定量成果用于统计剖析。

1.8统计学办法

选用SPSS 16.0软件包剖析，计量材料用x±s标明，选用方差剖析和t查验，以P<0.05为差异有统计学含义。

2成果

在CTGF表达方面，中药组和西药组的CTGF mRNA含量显着高于模型组，差异有统计学含义（P<0.05），但中药组与西药组比较，差异无统计学含义（P>0.05）；在Osterix表达方面，中药组和西药组的Osterix mRNA含量显着高于模型组，差异有统计学含义（P<0.05），且中药组的Osterix mRNA含量高于西药组（P<0.05）（表2）。

3评论

中医学以为骨质疏松属“骨痿“领域。《素问·痿论》云：“此乃肾水缺乏，水不堪火；则骨枯髓虚，故足不任身，发为骨痿。”其病因病机，当首责于肾虚。因为各种原因导致肾（气、阴、阳）的缺乏，影响骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充养，易发作骨骼软弱无力之证，即骨质疏松性骨折。一起，中医学亦以为骨质疏松性骨折愈合就是“瘀去、重生、骨合”的进程，且在“肾主骨”理论指导下进行组方用药，国内的研讨[4]标明补肾中药进步了机体内排泄腺体系的功用，改进了下丘脑-垂体-性腺轴的功用，添加了体内的性激素，调整了内环境，然后到达按捺骨吸收，添加骨构成的意图，起到进步骨量的效果。魏合伟等[5-6]的研讨已证明以“补肾法”拟定的中药骨康方对骨代谢有双向效果，既可按捺骨吸收，又可促进骨构成，缩短再造周期，进步骨生物力学功用，改进骨的质量，是一个较抱负的医治骨质疏松症的药物。一起，发现其含药血清中含有类性激素样效果的物质；能促进成骨细胞增殖和矿化，并促进成骨细胞排泄Ⅰ型胶原。

本研讨所用方由黄芪、补骨脂、淫羊藿、菟丝子、肉苁蓉、熟地、白芍等组成，全方诸药共奏补肾壮骨、健脾益气之成效。该方以补骨脂补肾助阳壮骨为君药。辅之肉苁蓉、淫羊藿、菟丝子加强其补肾壮阳之功为臣药。同時配以黄芪补中益气；熟地、白芍滋阴益精，培补后天生化之源以充肾精，又可到达补中寓通，补而不滞的意图，共为佐药，故本方具有补肾壮骨、健脾益气的效果。

骨折修正的终究意图是尽可能康复受伤骨的最大力学强度，修正骨折不只要康复骨形状的接连，更重要的是重建骨的支撑功用[7]。骨痂被以为是一种黏弹性物质，会跟着骨愈合进程而发作改动，由此呈现刚度与强度改动的不同步[8]。张胜利等[9]的研讨标明，骨质疏松后，皮质骨和松质骨的生物力学功用均发作了改动：在骨折愈合的不一起期骨痂部分的形状、截面积、均匀性等发作改动，关于骨质疏松骨折而言，骨皮质变薄，骨弹性下降，骨脆性添加，骨骼的生物力学功用下降。跟着分子生物学的开展，人们对骨折愈合的知道不断深化，现已知有很多的细胞成长因子在骨折愈合的不同阶段参加并调控了本质进程，如CTGF及Osterix因子对骨细胞的增殖和分解有重要效果。

CTGF是CCN宗族中的成员，是一种由349个氨基酸组成，分子量为34～38 KD的富含半胱氨酸的排泄肽，现在该宗族共有CTGF/fisp-12，cef10/Cyr61和Nov三个成员，参加了体内的多种病理生理进程，在骨折愈合中发挥重要效果。研讨标明[10-11]，其可促进软骨细胞、成长板软骨细胞、肥壮软骨细胞的增殖，并参加膜内骨化和骨建模或重塑，因而在保持骨量方面有重要效果。在本研讨中，中药组和西药组的CTGF mRNA含量显着高于模型组，差异有统计学与含义，阐明补肾健脾中药复方能进一步进步骨痂的成长。

Osterix是一种含有锌指结构的，对成骨细胞分解很重要的转录因子，归于Sp/XKLF宗族，定位局限于细胞核。它只在发育的骨安排中特异表达，被Lee等[12]以为是直接调理骨构成protein-2-runx2通路首要因子。另一方面，Osterix被以为是sox9和软骨细胞的一种负向调控因子，可阻挠骨或软骨的祖细胞向软骨细胞的分解。Baek等[13]的研讨标明，Osterix失掉能够推迟成骨细胞的老练，导致不老练的成骨细胞的堆集和削减骨构成的成骨细胞功用的缺点，无显着骨吸收，因而，以为Osterix在活跃调控成骨细胞分解和骨构成具有重要效果。Kang等[14]用机械牵张力结合超声波影响成骨细胞前体细胞，发现Osterix结合机械影响可加速成骨细胞的基质老练。Sinha等[15]以为，Osterix是成骨细胞特异性转录因子，它能激活前期成骨细胞分解成更多老练的骨细胞。在本研讨中，中药组和西药组中的Osterix mRNA含量显着高于模型组，差异有统计学含义，且中药组的Osterix mRNA含量高于西药组，差异有统计学含义，阐明补肾健脾中药复方在进步骨痂的成长有显着的影响。

综上所述，补肾健脾中药复方能在必定程度上可促进骨痂的成长，然后促进骨折愈合，为防治骨质疏松性骨折、促进骨折愈合的医治办法供给了一种新的途径。

[参考文献]

[1]Fonseca H，Moreira-Gon？觭alves D，Coriolano HJ，et al.Bone quality：the determinants of bone strength and fragility[J].Sports Med，2014，44（1）：37-53.

[2]程英豪，罗毅文，赵可伟，等.补肾健脾活血法对SD大鼠骨折愈合进程中骨痂显微结构改动的影响[J].新中医，2010， 42（8）：126-127.

[3]周晓中，董启榕，张健.大鼠股骨闭合骨折模型的制造[J].东南大学学报（医学版），2007，26（1）：60-62.

[4]李颖，白波，吴伙燕，等.补肾健脾中药复方对去势大鼠血清中Bcl-2和Bax水平的影响[J].中华中医药杂志，2012， 27（4）：1120-1123.

[5]魏合伟，林一峰.中药骨康含药血清中类雌二醇样物质含量的测定[J].中医正骨，2003，15（11）：14-16.

[6]李颖，黄宏兴，庄洪，等.中药骨康对去势大鼠骨质疏松效果机制的试验研讨[J].中华中医药杂志，2009，24（2）：160-163.

[7]夏群，苗军，张继东，等.周围神经体系对骨折愈合影响的试验研讨[J].中华伤口骨科杂志，2003，5（3）：233-235.

[8]贺小兵，卢卫忠，唐康来，等.骨构成蛋白和转化成长因子-β对兔尺骨骨折愈合后生物力学功用的影響[J].我国修正重建外科杂志，2003，17（3）：2185-2188.

[9]张胜利，王全平.骨质疏松性骨折愈合进程中骨痂部分生物力学改动的试验研讨[J].西安医科大学学报，2001，22（6）：558-560.

[10]Takigawa M，Nakanishi T，Kubota S，et al.Role of CTGF/HCS24/ecogenin in skeletal growth control[J].J Cell Physiol，2003，194（3）：256-266.

[11]Tsai HC1，Su HL，Huang CY，et al.CTGF increases matrix metalloproteinases expression and subsequently promotes tumor metastasis in human osteosarcoma through down-regula？鄄ting miR-519d[J].Oncotarget，2014，5（11）：3800-3812.

[12]Lee DS，Choung HW，Kim HJ，et al.NFI-C Regulates Osteo？鄄blast Differentiation via Control of Osterix Expression[J].Stem Cells，2014，32（9）：2467-2679.

[13]Baek WY，Lee MA，Jung JW，et al.Positive regulation of adult bone formation by osteoblast-specific transcription factor osterix[J].J Bone Miner Res，2009，24（6）：1055-1065.

[14]Kang KS，Lee SJ，Lee HS，et al.Effects of combined mechanical stimulation on the proliferation and differe？鄄ntiation of pre-osteoblasts[J].Exp Mol Med，2011，43（6）：367-373.

[15]Sinha KM，Zhou X.Genetic and molecular control of osterix in skeletal formation[J].J Cell Biochem，2013，114（5）：975-984.

（收稿日期：2017-03-08 本文修改：许俊琴）