红细胞溶血现象红细胞溶血实验检测化妆品眼刺激性的开始研讨_疾病_

刘肃　何华红?戚莉莉

[摘要] 意图评论红细胞溶血试验在化妆品眼影响性检测中的适用性。办法选用9种化妆品产品进行眼影响试验，断定家兔红细胞50%发作溶血时的化妆品浓度（HD50值）和血红蛋白变性指数（DI，%），核算影响指数IP= HD50/DI，以IP=HD50/DI值作为点评标准，进行眼影响性分级。将红细胞溶血试验影响性分级成果与家兔眼影响试验（Draize eye test）成果进行分级共同性比较，开始剖析体外试验的适用性。成果红细胞溶血试验与动物试验成果比较中，9种样品中有7种成果共同，共同率为77.8%（相关性为0.4962）。定论虽然试验成果阐明两者有必定的相关性，但多方面而言，红细胞溶血试验能否真实代替动物试验还有待商讨。

[关键词]化妆品；眼影响性试验；代替办法；红细胞溶血试验

[中图分类号] R115 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）16-188-04

Preliminary study on Red blood cell hemolysis test of draize alternatives

LIU Su HE Huahong QI Lili

Guangzhou Institute for Drugs，Guangzhou 510160， China

[Abstract] Objective To study the red blood cell hemolysis test on the applicability of the cosmetic eye irritation test. Methods 9 kinds of cosmetic products are chosen as the subjects， and determine the subjects of rabbit red blood cell hemolysis occurs in 50% subjects （HD50） and the initial concentration of hemoglobin denaturation index （DI， %）， the calculation of IP=HD50/DI， with IP=HD50/DI value as evaluation standard， make eye irritant grading. Results excitant grading erythrocyte hemolysis test and animal experiment results are compared， and grading consistency preliminary analysis the applicability of the in vitro. Results： Red blood cell hemolysis test and animal experiment result comparison， seven of nine subjects content is consistent， consistent rate was 77.8%（probability=0.4962）.Conclusion Though the experiment results show that both have certain relevance， but many ways， red blood cell hemolysis test failed to truly replace animal testing.

[Key words] Cosmetics； Eye irritation trial； Alternative methods； Red blood cell hemolysis test

眼影响性是指动物的眼睛外表（包含角膜，巩膜及结膜部分）接触到化学物质然后发作炎症反响的进程，这个进程有可逆的，也有不可逆的。化妆品眼影响性安全点评办法现在多用家兔试验即兔的眼影响性试验（Draize eye test），该试验办法于1944年树立，现在仍是测定急性眼毒性的国际标准，但由于该试验依托试验人员肉眼调查评分给出成果，存在必定的主观性；一起试验室与试验室之间的变异性也使该试验存在必定差错。并且近年来从动物维护和动物福利的视点动身，国际上多种代替动物试验的体外试验现已树立并被验证成为检测标准[1-4]。

红细胞溶血试验现已被归入到欧洲委员会/英国内务府展开的代替家兔眼影响试验之一，日本（Japanese ministry of health and welfare，MHW）/JCIA也现已在6～9个试验室进行了相似试验，成果显现[1]，红细胞溶血试验的试验室间的重复性较好。虽然它与兔眼影响性试验中的MAS值的相关性不行强（-0.631），但仍可比较断定的从样品平分辨出强影响物。

我国已树立了红细胞溶血试验办法，并得出红细胞溶血试验的成果与兔眼影响性试验具有较好相关性这必定论。张文改等[4-6]以为该试验办法适合点评洗发护发类化妆品的眼影响性，能正确区分眼影响性等级为轻影响性及其以下影响等级的化妆品；廖艳等[7]的研讨成果也标明红细胞溶血试验可用于代替兔眼影响性试验。

本研讨拟在我所树立兔红细胞溶血试验模型，将其使用于化妆品质料和产品眼影响性的检测与点评，以调查它代替动物眼影响性试验用于化妆品安全性点评的或许性及使用远景。

1 材料与办法

1.1 样品及试验动物

悉数样品均来源于广州市药品查验所药理室2014年1～9月送检的部分化妆品产品，共9个批次样品，其间面膜类2个，洗发类1个，去角质类2个，洁面类4个。悉数样品均于密闭、室温（22℃）下保存。endprint

试验用家兔来自广州市药品查验所动物房，经检疫后选用健康成年白色家兔，性别不限，雌性不孕。

1.2 首要仪器及试剂

首要仪器：日立U-3900紫外分光光度计，低温高速28RS离心机（Biofuge），电子天平AB204-S，六孔水浴TW12。

首要试剂：十二烷基硫酸钠（SDS），广州学友生物科技有限公司；二甲亚砜（DMSO），美国AR公司；草酸钾，广州化学试剂厂。

1.3 试验办法

1.3.1 红细胞溶血试验红细胞悬液的制备：健康家兔心脏取血7mL，加2%草酸钾溶液1mL，制备成新鲜抗凝兔血，加PBS 10mL稀释，4℃冰箱保存备用。

样品悬液的制备：依据预试验，挑选适合的终浓度，制造样品系列溶液。每种样品均树立5个试验剂量。首选PBS为溶剂，关于不溶于PBS的样品选用DMSO为溶剂（终浓度≤0.5%）。有必要确保各稀释样品悬液充沛混匀。

溶血及蛋白变性测定：样品组每个浓度2支具塞试管，每管参加样品悬液10mL；阴性对照组2支具塞试管，每管参加PBS 10mL；阳性对照组2支具塞试管，每管参加蒸馏水 10mL。每支试管参加0.2mL稀释兔血，悄悄混匀，37℃孵育30min。完毕后，离心10min，2000r/min，汲取上清液移入比色皿内，于分光光度计540nm，560nm及575nm测其吸光度（A）值。按公式①核算溶血率（%），公式②核算血红蛋白变性指数（DI，%）。

①

②

R1为空白对照蒸馏水的离心上清液A575/A540值；R2为样品离心上清液A575/A540值；R3为阳性对照SDS离心上清液A575/A540值[2]

首要调查目标：50%红细胞发作溶血时的样品浓度（HD50）、蛋白质变性指数（DI）、HD50与变性变性指数DI的比值（IP=HD50/DI）。

阳性对照：以十二烷基硫酸钠（SDS）为阳性对照，终究试验浓度为100mg/L。

1.3.2 家兔眼影响试验（Draize eye test）样品按不同剂量滴入每只试验动物一侧眼结膜囊内，另一侧为自身对照，在规则的时刻距离内，调查角膜、虹膜和结膜的反响并评分，以点评样品对眼睛的影响效果[6]。

试验操作：悄悄摆开家兔一侧眼睛的下眼睑，将样品0.1mL或0.1g敏捷滴入眼结膜囊中，令眼睑被迫闭合2～3s，以避免样品丢掉，另一侧眼睛不作任何处理以作自身对照。滴入样品后24h内不冲刷眼睛。若试验成果显现样品有影响性，则另选用3只家兔进行冲刷效果试验，即给家兔眼滴入样品后30s，用生理盐水轻柔快速冲刷至少30s。在滴入样品后1、24、48、72h以及第4天和第7天对动物眼睛进行查看，调查结膜、角膜及虹膜的反响，并在24h时进行荧光素钠（1%，生理盐水制造）查看。如果在72h影响反响消失，即停止试验。如有累及角膜或有其他眼影响效果，7d内不康复者，则持续调查至21 天。每次查看时均按《化妆品卫生标准》（2007）中眼危害的评分标准记载眼影响反响的积分，最后按分级标准对受试样品进行眼影响性分级[4，6]。

1.4 计算学处理

使用STATA计算软件剖析数据。选用秩和查验法进行红细胞溶血试验影响性分级成果和动物试验分级成果进行比较，判别两种试验成果分级的频数不同是否存在计算学含义。

2 成果

2.1 红细胞溶血试验成果

溶血率与样品浓度存在必定的线性关系，以样品浓度（mg/L）为横坐标，溶血率为纵坐标可求得HD50值（R2≥0.95）。进而，依据公式可求得DI及IP=HD50/DI。见表1。

2.2 眼影响试验与红细胞溶血试验的分级成果比较

动物试验成果能够分为无影响性（Ⅰ级）、弱小影响性（Ⅱ级）、轻度影响性（Ⅲ级）和严峻影响性（Ⅳ级）4个等级。

红细胞溶血试验的眼影响分级为：L/D≥10、1≤L/D<10 、0.1 ≤L/D<1和L/D<0.1别离标明无影响性（Ⅰ级）、弱小影响性（Ⅱ级）、轻度影响性（Ⅲ级）和严峻影响性（Ⅳ级）4个等级。

本次试验测得，9种化妆品样品中，有7种动物试验与红细胞溶血试验分级成果共同，1种不相符，还有一种无法取得成果。见表2。

依据STATA计算剖析成果，probability= 0.4962，故按单向有序RC表材料进行秩和查验，成果显现这两种试验分类等级的频数的不同不明显，即在必定程度上红细胞溶血试验可代替动物试验。本试验成果红细胞溶血试验与动物试验成果相关性：9种物质中有7种分级成果共同。

3 评论

红细胞溶血试验作为动物眼影响试验的代替办法，面世已有20多年，科学家们研讨了这两种办法的相关性、共同性和可靠性等，定论是根本承认红细胞溶血试验能够用于眼影响性的点评，并有较好的精确性和可重复性。惋惜的是，公认的眼影响性点评标准一向未有断定。红细胞溶血试验的根本原理是化学物质对红细胞膜的损坏然后发作胞质内蛋白的变性继而引起一系列的炎性反响[3，8-12]。不同化学物质损害红细胞的详细机制或许存在差异，如外表活性剂可损坏膜的脂质结构，导致膜脆性添加和溶解，而某些酸、碱或有机溶剂可引起大分子蛋白质的沉积/变性，而某些漂白剂和过氧化物对蛋白质的烷化和氧化进犯有或许并不表现为细胞膜溶解。一般大多数“无或弱的影响物”不引起溶血和蛋白变性：“中度或严峻影响物”仅引起溶血而较少引起蛋白变性；“强或腐蚀性物质”易形成严峻溶血及蛋白变性。当时较为合理的动物试验代替计划是首要经过物理化学特性预判物质的影响性程度，然后选用多步体外试验“自下而上（首要进行非影响性试验）”办法精确辨认非影响物，选用“自上而下（首要进行影响性试验）”办法精确辨认严峻影响物[13]。因而，本试验挑选膜溶解（溶血）和血红蛋白变性两个检测结尾，与仅用单一结尾的代替办法比较，本试验能掩盖不同损害机制，试验成果更具有代表性。endprint

也有研讨标明，溶血试验中，选用小型猪红细胞和大鼠红细胞检测，前者更简单得出严峻影响性物质的分类成果，提示大型哺乳动物或许比啮齿类红细胞更挨近人类而适合进行溶血试验[14]，咱们的试验选用家兔，更有代表性。

咱们一起也看到了局限性：一方面，溶血试验进程中存在太多不稳定要素，并且试验中样品品种有限，未能代表性地反响所属品种的成果；另一方面，在试验进程中，样品的制造有必定搅扰性：磨砂膏等难溶于溶剂或者是混合不均匀；样品中色素影响吸光度的测定，然后可影响成果的精确性。酸性物质自身会发作蛋白变性效果，所以关于酸性物质的点评也应慎重[11]。别的有报导显现，溶血试验关于链烷醇胺和酒精类物质的检测阳性率较低，可呈现假阴性成果。

[参考文献]

[1] 程树军，焦红.试验动物代替办法原理与使用[M].北京：科学出版社，2010：285-304.

[2] Eloísa NA，Rosaura de FP，Octávio AFP，et al.A Reassessment of the In Vitro RBC Haemolysis Assay with Defibrinated Sheep Blood for the Determination of the Ocular Irritation Potential of Cosmetic Products：Comparison with the In Vivo Draize Rabbit Test[J].ATLA ，2008，21（12）：275-284.

[3] 陆泽安，郑赛华，马来记，等.绵羊红细胞溶血试验用于化妆品眼影响试验的动物代替办法研讨[J].日用化学品科学：2013，1（36）：23-27.

[4] 张文改，杨杏芬.眼影响试验的代替办法及使用战略研讨进展[J].华南防备医学，2007，33（1）：27-31.

[5] 张文改，杨杏芬.根据细胞的眼影响性体外代替办法树立与化妆品限影响性逐渐检测战略的开始研讨（硕士学位论文）[D].广州：中山大学，2007：15-18

[6] 中华公民共和国卫生部.化妆品卫生标准（2007年版）[M].北京：公民卫生出版社，2007：15.

[7] 廖艳，王雪，张立实，等.溶血试验作为眼影响试验代替办法的研讨[J].现代防备医学，2002，29（4）：593-595.

[8] 刘天强，肖丹.眼影响性体外点评办法研讨进展[J].亚太传统医药，2009，5（5）：130-132.

[9] 郭翔，杨杏芬.树立离体兔眼试验办法及其代替Draize试验的使用研讨（硕士学位论文）[D].广州：中山大学，2009：21-23

[10] 张文改，杨杏芬，杨颖，等.红细胞溶血试验作为眼影响性代替办法的开始研讨[J].我国防备医学杂志，2010，11（6）：544-547.

[11] 薛金玉，杨杏芬.根据细胞的眼影响试验代替办法的研讨进展[J].我国防备医学杂志，2009，7（10）：681-684.

[12] 王庆利，彭健.Draize眼影响性试验的点评[J].中药新药与临床药理，2005，7（5）：301-304.

[13] 杨军，宋健.化妆品原材料与终产品的眼影响动物试验代替战略[J].我国药理学与毒理学杂志，2013，11（27）：307.

[14] 敖华英，程树军，谈伟君.不同哺乳动物红细胞溶血代替眼影响试验的比较[J].Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2012，16（12）：2163-2166.