ctc循环肿瘤细胞2个：结直肠癌中miR—106b增强肿瘤细胞放疗反抗效果机制的开始剖析

杨丽君 万晓晨

[摘要] 意图 评论结直肠癌中miR-106b增强肿瘤细胞放疗反抗作用机制。 办法 选用RT-PCR技能检测结直肠癌细胞株傍边的miR-106b的表达，剖析其对放疗反抗的影响。 成果 检测SW620细胞放疗灵敏性，miR-106b过表达之后SW620细胞的生计分数显着高于对照组（P<0.05）；检测miR-106b按捺表达的SW480细胞放疗灵敏性，miR-106b安稳搅扰之后SW480细胞的生计分数要显着低于对照组（P<0.05）；平板克隆试验成果标明，SW620/plVTHM/miR-106b细胞增殖才能显着强于SW620/plVTHM细胞（P<0.05）。 定论 miR-106b能够强化细胞反抗射线导致的DNA损害，前进细胞修正DNA的才能，终究强化结直肠癌细胞放疗反抗作用。

[关键词] 结直肠癌；miR-106b；肿瘤细胞；放疗反抗；机制

[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）01-0029-03

Preliminary analysis on the mechanism of miR-106b enhancing the radioresistance of tumor cells in colorectal cancer

YANG Lijun WAN Xiaochen

Clinical Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of miR-106b enhancing the radioresistance of tumor cells in colorectal cancer. Methods The expression of miR-106b in colorectal cancer cell lines was detected by RT-PCR. Its impact on radioresistance was analyzed. Results The radiosensitivity of SW620 cells was detected. The survival score of SW620 cells after miR-106b overexpression was significantly higher than that in the control group（P<0.05）； the radiosensitivity of miR-106b to inhibit the expression of SW480 cells was detected， and the survival score of SW480 cells after miR-106b stable interference was significantly lower than that in the control group（P<0.05）； the results of plate cloning experiments showed that the cell proliferation of SW620/plVTHM/miR-106b cells was significantly stronger than that of SW620/plVTHM cells（P<0.05）. Conclusion miR-106b can enhance the cell resistance to radiation-induced DNA damage， improve the ability of cells repairing DNA， and ultimately enhance the radioresistance of colorectal cancer cells.

[Key words] Colorectal cancer； miR-106b； Tumor cells； Radioresistance； Mechanism

結直肠癌发作开展同遗传要素以及环境要素等存在密切联络，核算成果显现，结直肠癌临床发病率近年来呈现出显着升高的开展趋势。当时状况下，结直肠癌患者的医治主要是手术医治联合辅佐放疗[1]。有用放疗能够杀死癌症细胞，一起延伸细胞周期，改进手术医治作用。不过部分患者的放疗灵敏性比较低，远期作用不行抱负，因而放疗反抗作用机制成为结直肠癌研讨的一个热点问题[2]。本文研讨结直肠癌细胞株傍边的miR-106b表达，评论其同放疗反抗之间的联络，现报导如下。

1材料与办法

1.1一般材料

人结直肠癌细胞株SW480及SW620，动物小鼠购自省动物中心， 3～6周龄，男女参半，体重（20±2）g。恒温恒湿条件下养殖，保证无特定病原体。

1.2办法

1.2.1 细胞培育办法 SW480及SW620借助于慢病毒转染过表达或者是搅扰细胞株的培育箱傍边进行培育，设定温度37℃，5%的CO2，细胞运用10%的牛血清RPMI-1640培育基，增加50 U/mL青霉素，50 mg/mL的链霉素，于37℃、5%CO2培育箱内培育，运用0.5%的胰蛋白酶进行消化传代，选取处于指数成长阶段的细胞进行试验[3]。

1.2.2 装备试剂 细菌培育基的制造方面，LB液体培育基，主要成分为5.0 g的胰蛋白胨、10.0 g的酵母提取物、5.0 g的氯化钠，增加500 mL去离子水之后拌和，pH值升高至7.0，分装之后高压灭菌贮存[4]。增加抗生素当作培育基，LB固体培育基方面，在液体培育基傍边增加2.5%的琼脂粉，在高压灭菌之后冷却，混匀之后每个平板倒入20 mL的培育基，常温条件下冷却到凝结而且运用保鲜膜进行封装[5]。

1.2.3 细胞辐射处理及检测 运用5%的胰酶消化细胞制造得到单细胞悬液，剖析细胞的浓度，接种到6孔板，在培育箱傍边继续孵育9 h之后，运用Varian 2300加快器进行6MV-X线照耀，其间剂量率是2 Gy/min，细胞掩盖1 cm玻璃，完结剂量建成之后中止培育，而且吸去培育液。每孔傍边增加150 μL的DMSO继续振动5 min之后检测OD490 nm方位的详细数值[6]。

1.2.4 细胞辐射之后检测对克隆的影响 两组细胞接种到6孔板中，每组分红0 Gy、l Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy等不同的剂量，每个剂量组设置3个不同的复孔[7]。照耀之后的细胞置于常温条件下继续培育2周，期间依据pH值状况替换培育液。培育板孔傍边发现肉眼能够发现的克隆之后中止培育，去除培育液之后PBS清洗细胞重复冲刷[8]。运用甲醇继续固定，之后去除甲醛，运用1%的结晶紫乙醇溶液进行染色，洗去染液之后枯燥，并运用显微镜核算50个以上的克隆，然后核算克隆率（克隆数/细胞数×100%）及存活分数（受照耀细胞克隆率/对照细胞克隆率×100%）。将3次照耀得到的存活分数平均值当作成果[9]。

1.2.5 细胞周期试验 指数成长期的细胞在经过0 Gy或者是2 Gy照耀之后24 h及48 h后搜集细胞，运用PBS重复洗3遍，3000 r/min继续离心10 min，细胞沉积贮存到离心管傍边，吸净上清之后运用振动器充沛震动，增加l mL的冰乙醇，次日离心去除上清并运用PBS重复冲刷，增加50 μL的PBS及100 μg/mL RNA酶，在常温条件下水浴1 h，染色之后运用100意图尼龙网进行过滤，运用细胞仪剖析各个细胞时相占有的百分比[10]。

1.2.6 放疗灵敏性 将两组细胞制造成为单细胞悬液，运用1640培育基断定细胞的浓度为1×106/mL。在小鼠皮下接种0.1 mL的细胞悬液，试验进程傍边每3天运用游标卡尺来断定肿瘤最大径及笔直横径，肿瘤体积约为200 mm3之后运用8 GyX线进行照耀。每组4只用来核算抑瘤率，抑瘤率=（1-试验组体积/对照组体积）×100%[11]。

1.3核算学办法

运用SPSS18.0核算学软件对数据进行剖析，计量材料以均数±标准差（x±s）标明，样本均数比照运用随机设計的独立样本t查验，P<0.05为差异有核算学含义。

2 成果

2.1 miR-106b转染SW620细胞放疗后增殖才能比照

检测SW620细胞放疗灵敏性，miR-106b过表达之后SW620细胞的生计分数显着高于对照组（P<0.05），见表1。

2.2安稳搅扰miR-106b表达放疗处理后SW480细胞放疗灵敏性比照

检测miR-106b按捺表达的SW480细胞放疗灵敏性，miR-106b安稳搅扰之后SW480细胞的生计分数要显着低于对照组（P<0.05），见表2。

2.3 SW620 miR-106b过表达前后克隆构成率及存活分数比照

平板克隆试验成果标明，SW620/plVTHM/miR-106b细胞增殖才能显着强于SW620/plVTHM细胞（P<0.05），见表3。

3 评论

跟着我国居民物质生活的改进，结直肠癌的临床发病率日益上升，且患者的病死率较高。研讨人员从miRNAs及生物标志分子等不同范畴探究直肠癌放疗反抗作用机制，成果提示不同层面的分子机制存在显着的差异，且相互存在影响。肿瘤干细胞及放疗反抗之间的联络遭到研讨人员的注重[12]。有研讨标明miRNAs影响到生命进程的各个环节，如发育、细胞代谢、细胞凋亡及细胞分解等，经过这一途径影响到免疫功用[13]。miR-106b长度为2 Int，方位在染色体7q22-1，所属的基因簇较为保存，主要以多顺反子方式一起转录，其平行表达在肝、胃及前列腺等肿瘤傍边都体现得较为显着[14]。研讨人员借助于基因芯片发现结直肠癌傍边miR-106b表达要显着高于邻近的健康安排，miR-106b一方面在肿瘤病变方位的表达反常，另一方面在循环系统血液傍边的表达相同显着上升，在结直肠癌患者血液傍边的miR-106b的水平要显着高于健康人群[15]。这提示miR-106b对肿瘤增殖环节有重要影响，不过在肿瘤放疗环节傍边的影响还缺少相关的研讨。本研讨检测SW620细胞放疗灵敏性，成果显现miR-106b过表达之后SW620细胞的生计分数显着高于对照组（P<0.05）。

有研讨人员发现miR-106b在影响肿瘤增殖环节，能够加快结直肠癌从G1期向S期的过渡，而G1期及S期是放疗的灵敏期及反抗期[16]。通常状况下，高分解肿瘤对放疗的灵敏性比较差，低分解肿瘤细胞的放疗灵敏程度较高，相关研讨发现高分解细胞株SW480的放疗灵敏性比较差，而低分解细胞株SW620关于放射医治依然较为灵敏[17]。本研讨中，高分解细胞株（SW480）傍边的miR-106b表达要显着高于低分解的细胞株（SW620），而且表达水平同放疗灵敏性存在显着相关性。借助于一系列试验，如平板克隆试验、体外增殖试验等，咱们发现低表达的SW620细胞对放疗作用依然有着比较强的灵敏性，过表达的SW620对放疗反抗的作用较为显着。试验成果提示miR-106b能够借助于强化结直肠癌细胞抗凋亡的才能，来加快细胞G1/S期的过渡，然后强化放疗反抗作用。

本研讨中，检测miR-106b按捺表达的SW480细胞放疗灵敏性，miR-106b安稳搅扰之后SW480细胞的生计分数要显着低于对照组（P<0.05），一起平板克隆试验成果标明，SW620/plVTHM/miR-106b细胞增殖才能显着强于SW620/plVTHM细胞（P<0.05）。这提示miR-106b能够增强细胞反抗射线导致的DNA损害，强化细胞DNA损害之后的自我修正功用，经过这一途径强化细胞放疗反抗作用[18]。简言之，跟着肿瘤免疫学、分子生物学及生物医学工程等学科的前进，靶向医治的临床运用日益广泛，为逆转结直肠癌患者的放疗反抗作用供给了新思路，少量新药开发及详细运用的作用杰出[19]。跟着医学研讨的继续深化，信任经过深化剖析结直肠癌患者的放疗反抗作用机制，同靶向药物的研讨相结合，将进一步改进结直肠癌辅佐放疗的作用[20]。

综上所述，miR-106b能够强化细胞反抗射线導致的DNA损害，前进细胞修正DNA的才能，终究强化结直肠癌细胞放疗反抗作用。

[参考文献]

[1] 王艳俊，蒋永新，刘珊，等.上皮–间质转化在蒿甲醚逆转结直肠癌细胞放化疗反抗中的作用[J].临床与病理杂志，2017，37（2）：319-325.

[2] 方未晶，左志贵.EGFR表达与放疗反抗的联系及西妥昔单抗用于直肠癌术前放疗增敏的研讨发展[J].医学研讨杂志，2015，44（11）：6-10.

[3] Liu S，Song L，Zhang L，et al. miR-21 modulates resistance of HR-HPV positive cervical cancer cells to radiation through targeting LATS1[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications，2015，459（4）：679-685.

[4] 王艳俊，蒋永新，刘珊，等.同期放化疗诱导人结直肠癌细胞发作上皮-间质转化[J].临床与病理杂志，2017，37（1）：115-120.

[5] 梁磊.EGFR通路与结直肠癌细胞放疗灵敏性的联系及西妥昔单抗对结直肠癌放疗灵敏性的影响作用研讨[J].我国农村卫生，2017，（12）：82.

[6] Hashida S，Yamamoto H，Shien K，et al. Hsp90 inhibitor NVP-AUY922 enhances the radiation sensitivity of lung cancer cell lines with acquired resistance to EGFR-tyrosine kinase inhibitors[J]. Oncology Reports，2015，33（3）：1499-1504.

[7] 周菲菲，黄荣，蒋军，等.直肠癌环氧化酶-2的表达猜测新辅佐放疗灵敏性的临床价值[J].有用医学杂志，2017，33（8）：1290-1293.

[8] 张世琳，韩北秋，何春波，等.术前肠癌恢复汤联合同步放化疗对结直肠癌患者免疫功用及生计质量的影响[J].现代中西医结合杂志，2017，26（15）：1627-1629.

[9] Li Y，Han W，Ni TT，et al.Knockdown of microRNA-1323 restores sensitivity to radiation by suppression of PRKDC activity in radiation-resistant lung cancer cells[J]. Oncology Reports，2015，33（6）：2821-2828.

[10] 刘芳芳.结直肠癌免疫医治的研讨及远景展望[J].世界华人消化杂志，2015（28）：4464-4472.

[11] 周菊梅，梁荣，朱苏雨，等.ET-1和PKM2在直肠癌安排中的表达与术前放疗作用的联系[J].我国医生杂志，2017，19（7）：1010-1013.

[12] 宋振玉，冷宁，陈尊玲.热疗对直肠癌患者放效果果及免疫功用的影响[J].山东医药，2016，56（41）：59-61.

[13] 张景淳，郑桐森，张艳桥.免疫评分在结直肠癌中的研讨发展[J].我国肿瘤，2017，26（8）：612-616.

[14] 孔令亨，丁培荣，姜武，等.PMS2基因胚系骤变结直肠癌患者免疫组化及微卫星不安稳的表达[J].广东医学，2017，38（10）：1499-1504.

[15] 刘德宝，徐忠法，范开席.晚期结直肠癌的医治战略[J].世界肿瘤学杂志，2016，43（5）：387-390.

[16] 冷宁，聂文，赵永利，等.链式CIK细胞免疫医治联适宜形调强放疗及微波热疗医治部分晚期直肠癌临床研讨[J].癌症发展，2016，14（9）：861-863.

[17] 艾毅钦，汪勇，赵川，等.Smac蛋白表达水平对猜测直肠癌术前放化疗灵敏性的临床含义[J].昆明医科大学学报，2015，36（6）：77-80.

[18] Mims J，Bansal N，Bharadwaj MS，et al.Energy metabolism in a matched model of radiation resistance for head and neck squamous cell cancer[J]. Radiation Research，2015， 183（3）：291-304.

[19] 蔡成，王建平，钟志凤，等.缺氧诱导因子1α和CD133猜测直肠癌患者新辅佐放化效果果的临床研讨[J].浙江大学学报（医学版），2017，46（1）：36-43.

[20] 侯生槐.低位直肠癌术前单纯化疗及放化疗联合干涉对保肛率、免疫功用的影响[J].我国有用医刊，2016，43（21）：49-51.

（收稿日期：2017-10-25）