羊膜干细胞：羊膜衍生膜负载干细胞经过PI3K/MAPK修正及优化软骨损害的评价

张治金　曾林如　朱芳兵　郭林　李倩晓

[摘要] 意图 探討人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）负载干细胞经过PI3K/MAPK修正及优化软骨损害的效果。 办法 新西兰白兔别离出骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）并与软骨细胞按4∶1接种于HAAM上，接种后7 d和14 d调查软骨细胞的修正及优化情况。细胞计数CCK-8法检测软骨细胞的存活率；TUNEL法检测软骨细胞凋亡发作；Western Blot法检测软骨细胞中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原，磷酸化蛋白p-PKC、p-p38、p-JNK和p-ERK蛋白表达水平。 成果 与对照组比较，试验组细胞存活率显着升高，细胞凋亡显着下降，差异具有统计学含义（P<0.05）；与对照组比较，试验组中Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原含量显着添加；PI3K/MAPK信号通路磷酸化蛋白含量改变显着，差异具有统计学含义（P<0.05）。 定论 羊膜衍生膜负载骨髓间充质干细胞能够修正和优化软骨的损害，且PI3K/MAPK信号通路在此进程中有重要效果。

[关键词] HAAM；BMSCs；软骨细胞；PI3K/MAPK

[中图分类号] R363 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）18-0031-04

Evaluation of acellular amniotic membrane loaded stem cells in repairing and optimizing cartilage injury by PI3K / MAPK pathway

ZHANG Zhijin1 ZENG Linru1 ZHU Fangbing1 GUO Lin2 LI Qianxiao3

1.Department of Orthopaedics， Xiaoshan District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City， Hangzhou 311201， China； 2.Department of Joint Surgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Dalian University， Dalian 116000， China； 3.Department of Cardiology， Hangzhou Red Cross Hospital， Hangzhou 310000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of human acellular amniotic membrane （HAAM） loaded stem cells in repairing and optimizing cartilage injury by PI3K/MAPK pathway. Methods Bone mesenchymal stem cells （BMSCs） were isolated from New Zealand white rabbits and were plated on HAAM combined with chondrocytes at 4：1. The repair and optimization of chondrocytes were observed at 7 and 14 days after inoculation. The survival rate of chondrocytes was detected by cell count CCK-8 method. The apoptosis of chondrocytes was detected by TUNEL method. Western Blot was used to detect the expression of type Ⅰcollagen， type Ⅱ collagen， expression levels of phosphorylated protein p-PKC， p-p38， p-JNK and p-ERK. Results Compared with that in the control group， the survival rate of the experimental group was significantly higher， and cell apoptosis of the experimental group was significantly reduced， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Compared with those in the control group， the typeⅠcollagen and typeⅡcollagen content in the experimental group increased significantly（P<0.05）， and the changes of phosphorylated protein content of PI3K/MAPK signal pathway was significant， the difference was significant（P<0.05）. Conclusion Acellular amniotic membrane loaded bone marrow mesenchymal stem cells can repair and optimize the damage of cartilage， and the PI3K/MAPK signaling pathway plays an important role in this process.

[Key words] HAAM； BMSCs； Chondrocytes； PI3K/MAPK

炎症、变老、伤口和其他各种疾病与骨性关节炎及关节软骨损害的发作密切相关。按捺软骨细胞降解，促进软骨细胞的成长可显着延平缓优化软骨损害[1，2]。软骨细胞是骨性损害的首要靶细胞，各种生化要素和机械要素效果于软骨细胞，可影响软骨细胞排泄细胞因子、软骨变性蛋白酶、各种炎性介质，它们可使软骨变性[3，4]。而骨性关节软骨的自我修正才能很差，怎么影响软骨细胞排泄胶原，改进软骨损害是临床骨科面对的重要问题之一。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类具有多项分解潜能的细胞，来历丰厚简单别离培育，已成为骨安排工程研讨中的最佳种子细胞[5]。人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）是一种从细胞滋养层衍化而来的半透明的薄膜，羊膜基底膜上含有多种胶原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖等成分，能够促进细胞的增殖分解和安排修正[6-8]。本研讨首要运用安排工程技术将骨髓间充质干细胞和软骨细胞栽培于HAAM上，调查软骨细胞在HAAM上的成长增殖情况，为修正和优化软骨损害的进一步研讨供给试验依据。

1 资料与办法

1.1 一般资料

一抗多克隆抗体Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原；p-p38、p-JNK、p-ERK、p-PKC、ACTB购于美国SantaCruz生物技术有限公司；二抗碱性磷酸酶符号山羊抗兔IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研讨所；Western Blot电泳仪（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）。

1.2 办法

1.2.1 试验分组及其处理 2只1月龄新西兰白兔，男女不限，BMSCs与软骨细胞按4∶1接种于HAAM上，调整总细胞终浓度为5.0×107/mL，随机分为以下各组：A组为HAAM-BMSCs-软骨细胞组（其间BMSCs：软骨细胞=4∶1，试验组）、B组为BMSCs-软骨细胞组（其间BMSCs：软骨细胞=4∶1，对照组）。接种后7 d、14 d调查软骨细胞的修正及优化情况。

1.2.2 BMSCs别离、培育和判定[9] 1月龄试验兔术区惯例消毒、铺巾后走骨穿，用骨髓穿刺针在股骨及胫骨近端进针，衔接10 mL注射器，抽取骨髓液4～5 mL，注入含肝素和DMEM/F12的离心管内，选用全骨髓贴壁别离挑选法别离、培育BMSCs细胞，制成细胞悬液，放入37℃、5%CO2培育箱中惯例培育。显微镜下调查细胞的成长情况，48 h后初次给予全量换液，流式细胞检测抗原表达，挑选外表抗原CD29、CD90、CD105和CD45进行判定，PBS为阴性对照，IgG-PE做为同型对照。

1.2.3 软骨细胞的别离、培育和判定[10] 取上述同一只兔，无菌条件下取双侧膝关节软骨，以PBS冲刷3次，用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm软骨块，参加0.25%的胰蛋白酶37℃消化。用200目不锈钢无菌滤网过滤，搜集细胞，接种到培育瓶中惯例培育，台盼蓝染色细胞活性>95%。取P3软骨细胞以1×105/mL浓度接种于涂多聚赖氨酸的盖玻片上培育3 d，4℃丙酮固定30 min，行Ⅱ型胶原免疫组化染色。

1.2.4 羊膜的制备与负载[11] 取健康剖宫产产妇的羊膜并进行相关传染性查验，成果均呈阴性。在超净台上清洗并别离羊膜，用含1000 U/mL庆大霉素+25 μg/mL两性霉素B的生理盐水浸泡20 min后，用胰蛋白酶于消化30 min，去除杂质细胞。制备成适宜巨细的羊膜鋪于培育皿中，按份额接种骨髓间充质干细胞和软骨细胞，37℃、5% CO2条件下培育。

1.2.5 CCK-8法检测细胞存活率 细胞依照对照组与试验组培育后，取细胞制备成细胞悬液，接种到96孔板中（100 μL/孔），37℃、5%CO2条件下过夜培育，隔天换液后参加10 μL CCK8试剂，37℃、5%CO2条件下孵育2 h，运用酶标仪在450 nm波利益测定OD值，核算细胞存活率。

1.2.6 TUNEL检测细胞凋亡 细胞依照对照组与试验组培育后，取细胞制备成细胞悬液，依照细胞凋亡检测试剂盒阐明逐步参加生物符号素，在荧光显微镜下查找荧光阳性细胞，依据阳性细胞所占百分率来核算DLBCL细胞的细胞凋亡率。

1.2.7 Western Blot法检测磷酸化蛋白表达水平 细胞依照对照组与试验组培育后，搜集细胞于冰上裂解2 h，4℃离心后搜集蛋白上清液。测定蛋白浓度后，将各组蛋白浓度总量调整为30 μg/μL，参加到10%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转膜后，用牛血清白蛋白关闭1 h，参加一抗4℃过夜。隔天用TBST洗膜3次，并参加二抗孵育1 h。TBST洗膜2次，TBS洗膜1次。用ECL显色液进行显色，并对各泳道条带进行灰度扫描，得出相应的蛋白表达量。

1.3 统计学处理

数据选用SPSS22.0软件处理，选用单要素方差剖析和Bonferroni's Multiple Comparison Test，成果用（x±s）标明。以P<0.05为差异具有统计学含义。

2 成果

2.1 骨髓间充质干细胞判定

使用Beckman counter流式细胞仪剖析大鼠间充质干细胞外表标志抗原。如封三图1所示，培育的第3代细胞已表达 BMSCs细胞表型阳性特征，其CD29、CD90、CD105，阳性率分别为96.72%、98.53%、98.99%；CD45呈阴性，阳性率为0.53%。流式成果标明，收成的高纯度的BMSCs可用于下一步试验。

2.2 软骨细胞判定

经ColⅡ免疫细胞化学染色可见细胞胞浆内的ColⅡ染成棕黄色。Ⅱ型胶原免疫组化染色显现，收成的高纯度软骨细胞可用于下一步试验，见封三图2。

2.3 CCK-8法检测细胞存活率

CCK8检测细胞存活率成果可知，与对照组比较，跟着培育时刻的延伸，试验组软骨细胞存活率显着增高，差异有统计学含义（P<0.01）。见图1。

2.4 TUNEL检测细胞凋亡成果

凋亡检测成果可知，与对照组比较，跟着培育时刻的延伸，试验组软骨细胞凋亡率显着下降，差异有统计学含义（P<0.01）。见图2。

2.5 磷酸化蛋白表达水平

用Western Blot法测得成果可知，跟着培育时刻的延伸，Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原、磷酸化蛋白p-PKC和p-ERK蛋白含量的蛋白水平显着上升，磷酸化蛋白p-p38和p-JNK的蛋白水平显着下降，差异有统计学含义（P<0.01）。见图3。

3 评论

人羊膜衍生膜（human acellular amniotic membrane，HAAM）是一种从细胞滋养层衍化而来的半透明的薄膜，羊膜具有抗黏附才能，炎性反响轻，纤维包裹少；一起HAAM抗原性极低，操控排挤反响的发作，具有杰出的生物相容性[12，13]。羊膜基底膜上含有多种胶原蛋白、纤维衔接蛋白、层粘连蛋白、糖蛋白和蛋白多糖等成分，这些有用成分增强了其抗拉力，为细胞成长供给了满足的三维空间结构；为细胞的增殖、分解供给丰厚的营养成分，而且有利于栽培在羊膜上的细胞粘赞同成长[13，14]。羊膜作为一种杰出易得的生物资料，易于加工、处理和运送，为安排工程学的研讨供给了便当的条件。研讨标明在人羊膜細胞外基质上负载培育的角膜细胞、结膜细胞、成纤维细胞、软骨细胞等均能杰出成长，并坚持本来的细胞功用[14，15]。

本研讨为了讨论羊膜衍生膜负载骨髓间充质干细胞经过PI3K/MAPK信号通路对损害软骨的维护效果，研讨成果标明跟着培育时刻延伸，软骨细胞的存活率逐步上升，细胞凋亡率逐步下降，能够排泄出Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原，阐明软骨细胞在羊膜衍生膜负载骨髓间充质干细胞的条件下能够成长杰出，处于良性增殖状况。PI3K/MAPK作为两条经典的细胞信号转导通路，可显着调控细胞增殖分解和细胞凋亡等进程[16]。PI3K是一种参加细胞成长及骨架重塑的重要磷脂酰肌醇激酶，也是重要的抗凋亡调理因子，活化后可导致脂质底物磷酸化并激活下流AKT，经过磷酸化效果激活或按捺其下流靶蛋白Caspase3、NF-κB、mTOR等，参加调理细胞凋亡与代谢进程[17，18]。一起，在哺乳类细胞中现已发现三条并行的MAPK信号通路，分别是p38MAPK、JNK/SAPK和ERK信号通路，它们在细胞的成长和分解、细胞的炎性反响及细胞凋亡等应激反响中起重要效果[19-21]。由Western Blot成果可知，磷酸化蛋白p-PKC和p-ERK的蛋白水平显着上升，磷酸化蛋白p-p38和p-JNK的蛋白水平显着下降，阐明羊膜衍生膜负载骨髓间充质干细胞的条件下能够促进PI3K信号通路的抗凋亡效果，且按捺MAPK信号通路的促凋亡效果，然后调控细胞增殖与凋亡的开展进程。

综上所述，在羊膜衍生膜负载骨髓间充质干细胞的效果能够经过有用调控PI3K/MAPK信号通路，促进软骨细胞的发作开展进程。进一步了解羊膜衍生膜负载骨髓间充质干细胞对软骨细胞的修正和活化机制，对医治软骨损害和骨关节疾病等具有重要的临床含义。

[参考文献]

[1] B.C. Sondergaard M.Sc.y，H. Wulfy，K. Henriksen M.Sc，et al. Calcitonin directly attenuates collagen type Ⅱ degradation by inhibition of matrix metalloproteinase expression and activity in articular chondrocytes[J]. Osteo Arthritis and Cartilage，2006，14（8）：759-768.

[2] Tian-Fang Lia，Kiminori Yukata，Guoyong Yin，et al.BMP-2 induces ATF4 phosphorylation in chondrocytes through a COX-2/PGE2 dependent signaling pathway[J].Osteoarthritis Cartilage，2014，22（3）：481-489.

[3] Wu JJ，Weis MA，Kim LS，et al.Type Ⅲ collagen，a fibril network modifier in articular cartilage[J]. J Biol Chem，2010，285（24）：18537-18544.

[4] 黄开，杨金华，王筱林，等.Pluronic F-127负载骨髓间充质干细胞和碱性成纤维细胞成长因子修正兔膝关节软骨残缺[J].临床医学，2011，31（12）：92-95.

[5] Martinez C，Hofmann TJ，Marino R，et al.Human bone marrow mesenchymal stromal cells express the neural ganglioside GD2：A novel surface marker for the identification of MSCs[J].Blood，2007，109（10）：4245-4248.

[6] Koizumi NJ，Inatomi TJ，Sotozono CJ，et al. Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane[J].Curr Eye Res，2000，20（3）：173-177.

[7] 钟金晟，梅芳，齐伟宏，等.聚乳酸/羟基磷灰石膜与人羊膜基质细胞联合构建骨安排工程细胞/支架复合体[J].我国安排工程研讨，2012，16（8）：1345-1348.

[8] 王日新.羊膜包裹羟基磷灰石复合资料修正爆裂性眶壁骨折[J].世界眼科杂志，2013；13（3）：605-606.

[9] 束波，刘志江，范芳.基质细胞衍生因子-1a预处理对大鼠骨髓间充质干细胞体外存活及旁排泄的影响[J].基础医学与临床，2012，32（8）：884-888.

[10] 洪佳琼，典雅，宋洁，等.人羊膜间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性及免疫按捺效果的比较[J].我国试验血液学杂志，2016，24（3）：858-864.

[11] 闫国和，粟永萍，艾国平，等.人羊膜负载猪骨髓间充质干细胞成长的形态学研讨[J]. 第三军医大学学报，2002， 24（7）：775-777.

[12] Eynch D，Wiese H，Maier G，et al. In vitro and in vivo cartilage engineering using a combination of chondrocyte-seeded long-term stable fibrin gels and polycaprolactone-based polyurethane scaffolds[J]. Tissue Eng，2007， 13（9）：2207-2218.

[13] 姜晓琪，史其林.羊膜在掌主干骨折中的临床使用研讨[J].中华临床医生杂志，2009，3（6）：1013-1016.

[14] 郭林，张治金. 脱细胞羊膜负载骨髓间充质干细胞修正软骨残缺的试验研讨[J].中华显微外科杂志，2012， 10（35）：399-401.

[15] 霍双枝，施萍，庞希，等.人羊膜负载人羊膜间充质干细胞对SD大鼠皮肤创面愈合的影响[J].我国医学科学院学报，2011，33（6）：611-614.

[16] 郁迪，莫绪明.PI3K/Akt和MAPK信号通路在缺血性脑损害中的维护效果[J]. 医学总述，2015，21（2）：210-213.

[17] 游晓星，马小华，刘良，等.专支原体巨噬细胞活化脂肽-2经PI3K/Nrf2诱导单核细胞表达HO-1和NQ01[J].中南医学科学杂志，2014，42（1）：6-10.

[18] Arslan F，Lai RC，Smeets MB，et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes increase ATP levels，decrease oxidative stress and activate PI3K/Akt pathway to enhance myocardial viability and prevent adverse remodeling after myocardial ischemia/reperfusion injury[J]. Stem Cell Res， 2013，10（3）：301-312.

[19] Wang Q，Yin XH，Liu Y，et al. K252a suppresses neuronal cells apoptosis through inhibiting the translocation of Bax to mitochondria induced by the MLK3/JNK signaling after transient global brain ischemia in rat hippocampal CA1 subregion[J]. J Recept Signal Transduct Res，2011，31（4）：307-313.

[20] 柯昌斌，黄晓霞，许先成，等. P38MAPK和PI3K/Akt信號通路在大鼠糖尿病神经病理性痛苦中的交互效果[J].临床麻醉学杂志，2010，26（9）：790-793.

[21] 刘斌，匡安仁. MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通道的基因变异与甲状腺癌的发作开展及诊治[J].生物医学工程学杂志，2012，29（6）：1221-1225.

（收稿日期：2017-03-01）