重组人粒细胞巨噬细胞影响因子：HPLC在注射用重组人粒细胞巨噬细胞影响因子冻干粉针剂主药含量测定中的使用

周飞燕+孔雯雯+杨丽菲

[摘要]意图 树立注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落影响因子（rhGM-CSF）冻干粉针剂中首要活性成分的HPLC的测定办法。办法 HPLC色谱条件中，色谱柱为TSK gel G3000SW（300.0 mm×7.5 mm，5 μm），活动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，流速为1 ml/min，自动进样20～40 μl，检测波长为280 nm。研讨该色谱条件是否能剖析rhGM-CSF冻干粉针剂中的各组分、试验重现性以及不同进样体积与各组分峰面积的线性关系。成果 检测出rhGM-CSF冻干粉针剂中的主成分为rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，rhGM-CSF蛋白进样量与峰面积呈杰出线性关系，R2>0.99，百分含量的RSD值均<3%。定论 该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂蛋白量在10～20 μg规模内的的活性成分含量。

[关键词]重组人粒细胞巨噬细胞集落影响因子；冻干粉针剂；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（c）-0104-04

[Abstract]Objective To establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection （rhGM-CSF） by HPLC.Methods The chromatographic condition of HPLC was chromatographic column （TSK gel G3000SW，300.0 mm×7.5 mm，5 μm），Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer，Flow rate was 1 ml / min，automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection，reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.Results The main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear （R2>0.99） and the percentage content of RSD values was less than 3%.Conclusion This method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.

[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor；Freeze-dried powder injection；High performance liquid chromatography

重組人粒细胞巨噬细胞影响因子冻干粉针剂（rhGM-CSF）是运用重组基因工程技术出产的重组蛋白药物[1]343-344，是一种细胞因子，首要用于医治因放、化疗引起的白细胞削减[2-5]，而且临床上能够医治溃疡、烫坏、烧伤等创面疾病[6-9]，其活性成分为重组人粒细胞巨噬细胞影响因子，该种类已被《我国药典》三部收载[1]343-344。《我国药典》未规则其制品的含量测定办法，只要求测定生物学活性（效价），选用的是TF-1依靠细胞株，用MTT染色法进行测定，合格规模是标明活性的80%～150%[10]96-98，277-279。因为活性测定办法自身的稳定性较差，难以实现准确的操控，因而，为更好地操控产品质量，宜尽早树立其主药成分含量测定办法。

高效液相色谱法（HPLC）中收载rhGM-CSF原液纯度的检测办法，是选用凝胶色谱柱为固定相，磷酸盐缓冲液为活动相，在波长280 nm处进行检测，运用面积归一化法核算意图蛋白百分比含量[10]59-63。现在，高效液相用于药品的定性、定量的剖析运用现已很广泛[11-15]，可是用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的办法尚稀有报导，故本研讨经过参阅药典中rhGM-CSF原液纯度检测的办法，承认该法检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的可行性。

1资料与试药

1.1仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（配有G1315B DAD 检测器、G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱，德国安捷伦科技有限公司）；化学工作站（ChemStation，版本号：Rev.A.10.01[1635]，美国安捷伦科技有限公司）；BS124S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，粒径5 μm，日本东曹株式会社公司）。

[摘要]意图 树立注射用重组人粒细胞巨噬细胞集落影响因子（rhGM-CSF）冻干粉针剂中首要活性成分的HPLC的测定办法。办法 HPLC色谱条件中，色谱柱为TSK gel G3000SW（300.0 mm×7.5 mm，5 μm），活动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，流速为1 ml/min，自动进样20～40 μl，检测波长为280 nm。研讨该色谱条件是否能剖析rhGM-CSF冻干粉针剂中的各组分、试验重现性以及不同进样体积与各组分峰面积的线性关系。成果 检测出rhGM-CSF冻干粉针剂中的主成分为rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，rhGM-CSF蛋白进样量与峰面积呈杰出线性关系，R2>0.99，百分含量的RSD值均<3%。定论 该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂蛋白量在10～20 μg规模内的的活性成分含量。

[关键词]重组人粒细胞巨噬细胞集落影响因子；冻干粉针剂；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）05（c）-0104-04

[Abstract]Objective To establish the method of the main active ingredients in recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor freeze-dried powder injection （rhGM-CSF） by HPLC.Methods The chromatographic condition of HPLC was chromatographic column （TSK gel G3000SW，300.0 mm×7.5 mm，5 μm），Mobile phase was 0.1 mol/L phosphate buffer，Flow rate was 1 ml / min，automatic sampling was 20-40 μl and detection wavelength was 280 nm.Analyzing the ingredients of rhGM-CSF freeze dried powder injection，reproducibility and linear relationship between different sample volume and peak area of each component under this chromatographic condition were studied in this experiment.Results The main components of rhGM-CSF freeze dried powder injection were rhGM-CSF protein and human albumin.The rhGM-CSF protein sample volume and peak area were good linear （R2>0.99） and the percentage content of RSD values was less than 3%.Conclusion This method could be used to detect the active component content of the rhGM-CSF lyophilized powder for injection protein with 10-20 μg scope.

[Key words]Recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor；Freeze-dried powder injection；High performance liquid chromatography

重組人粒细胞巨噬细胞影响因子冻干粉针剂（rhGM-CSF）是运用重组基因工程技术出产的重组蛋白药物[1]343-344，是一种细胞因子，首要用于医治因放、化疗引起的白细胞削减[2-5]，而且临床上能够医治溃疡、烫坏、烧伤等创面疾病[6-9]，其活性成分为重组人粒细胞巨噬细胞影响因子，该种类已被《我国药典》三部收载[1]343-344。《我国药典》未规则其制品的含量测定办法，只要求测定生物学活性（效价），选用的是TF-1依靠细胞株，用MTT染色法进行测定，合格规模是标明活性的80%～150%[10]96-98，277-279。因为活性测定办法自身的稳定性较差，难以实现准确的操控，因而，为更好地操控产品质量，宜尽早树立其主药成分含量测定办法。

高效液相色谱法（HPLC）中收载rhGM-CSF原液纯度的检测办法，是选用凝胶色谱柱为固定相，磷酸盐缓冲液为活动相，在波长280 nm处进行检测，运用面积归一化法核算意图蛋白百分比含量[10]59-63。现在，高效液相用于药品的定性、定量的剖析运用现已很广泛[11-15]，可是用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的办法尚稀有报导，故本研讨经过参阅药典中rhGM-CSF原液纯度检测的办法，承认该法检测rhGM-CSF冻干粉针剂主药含量的可行性。

1资料与试药

1.1仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪（配有G1315B DAD 检测器、G1311A四元梯度泵、G1322A在线脱气装置、G1316A柱温箱，德国安捷伦科技有限公司）；化学工作站（ChemStation，版本号：Rev.A.10.01[1635]，美国安捷伦科技有限公司）；BS124S型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；TSK gel G3000 SWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm，粒径5 μm，日本东曹株式会社公司）。

3.2 HPLC检测法对混合组分的适用性

本文选用HPLC法对rhGM-CSF 冻干粉针剂及其单组分进行检测，成果表明，该法可检测出rhGM-CSF冻干粉针剂中的主成分rhGM-CSF蛋白和人血白蛋白，各峰之间的别离度较好；HPLC办法的重现性较好，相同进样体积条件下，其峰面积及峰面积百分比的RSD均<1%；不同进样量（20～40 μl）与各组分的峰面积显现显着线性关系，R2均>0.99，故该法可用于检测rhGM-CSF冻干粉针剂中的活性成分的含量百分比。别的，因为不同样品的峰面积与其进样量呈必定的线性关系，还可在必定规模内依据rhGM-CSF蛋白峰面积的改变，估测其对应的含量。

运用HPLC法检测rhGM-CSF冻干粉针剂中rhGM-CSF含量，是原液点评的一种直观、合理、有用的技术手段，具有重现性好和操作简洁等长处，能很好地满意质控的要求，对完善该种类的质量标准供给了参阅。

[参阅文献]

[1]国家药典委员会.我国药典[M].三部.北京：我国医药科技出版社，2015：343-344.

[2]陈玉林，杨长福，韦华军，等.重组人粒细胞影响因子、重组人粒细胞巨噬细胞影响因子对肿瘤患者化疗后升高白细胞、中性粒细胞作用的比较[J].吉林医学，2016，37（2）：323-324.

[3]雷双根，余小芬，谢春伟，等.重组人粒细胞集落影响因子医治乳腺癌术后化疗后骨髓按捺的作用[J].有用临床医学，2014，15（7）：28-30.

[4]秦凌阳，晁占湖，闫怀莲.短期运用重组人粒细胞影响因子注射液医治儿童中性粒细胞削减症的临床研讨[J].我国现代药物运用，2014，8（4）：153-154.

[5]李北兵，白明，杨莹.重组人粒细胞-巨噬细胞集落影响因子的研讨进展总述[J].黑龙江医药，2010，23（3）：407-408.

[6]易吉秀.重组人粒细胞-巨噬细胞集落影响因子医治前期糖尿病足溃疡作用调查[J].我国药房，2011，22（10）：909-911.

[7]蔡景宁，孙玉静，谢晓繁，等.重组人粒细胞巨噬细胞集落影响因子凝胶对深Ⅱ度烧伤创面溶痂的作用剖析[J].我国临床医师杂志，2017，45（1）：39-42.

[8]邱学文，盛颖萍，王甲汉，等.联合运用rhGM-CSF和莫匹罗星于烧伤后剩余创面的作用调查[J].我国医院药学杂志，2016，36（9）：748-784.

[9]李霞，杨文芳.重组人粒细胞集落影响因子联合护理医治放射性口腔炎作用调查[J].现代中西医结合杂志，2013， 22（2）：209-210.

[10]国家药典委员会.我国药典[M].四部.北京：我国医药科技出版社，2015.

[11]赵辉，李增礼，周乐春，等.HPLC法测定重组人干扰素α2b注射液中吐温80的含量[J].我国生物制品學杂志，2012，25（5）：623-629.

[12]刘璐，蔡峰，王公孝，等.A群C群脑膜炎球菌结合疫苗游离蛋白含量HPLC检测办法的树立[J].我国生物制品学杂志，2016，29（11）：1200-1204.

[13]田宇柔，甄亚钦，王鑫国，等.半枝莲配方颗粒HPLC指纹图谱及含量测定办法研讨我国药学杂志[J].我国生物制品学杂志，2016，29（20）：1795-1799.

[14]毕嘉益，芦红代，程思谟，等.HPLC法测定枸橼酸西地那非原料药的含量及有关物质[J].沈阳药科大学学报，2015， 32（7）：527-530.

[15]黎春彤，李翔，马建丽，等.HPLC一起测定防风通圣丸中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的含量[J].药物剖析杂志，2016，36（1）：176-180.

（收稿日期：2017-03-16 本文修改：祁海文）