小鼠灌胃针：使用小鼠灌胃针和点样吸头树立的大、小鼠肺泡灌洗新方法

杨彪+肖纯凌

[摘要]意图 树立一套新式易操作的大、小鼠肺泡灌洗新办法。办法 依托小鼠灌胃针和电泳点样吸头为东西，树立一套新式的大、小鼠肺泡灌洗操作系统。别离运用10 ml或1 ml的无菌注射器合作插管东西完结肺泡灌洗操作。研讨中对10只雄性Wistar大鼠（体重220～250 g）和10只雄性CB17-SCID小鼠（体重24～28 g）进行插管和肺泡灌洗液搜集。成果 共完结20次大、小鼠的插管和肺泡灌洗操作，成功搜集到1×107个大鼠肺泡巨噬细胞和3×106个小鼠肺泡巨噬细胞。定论 运用小鼠灌胃针和电泳点样吸头完结的搜集大、小鼠肺泡灌洗液新办法，能够被广泛用于大、小鼠呼吸系统疾病模型的研讨。

[关键词]试验技能；小鼠灌胃器；电泳点样吸头；大鼠；小鼠

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）12（b）-0132-03

A new method of alveolar lavage in rat and mouse set up applying mouse stomach needle and point sample suction head

YANG Biao1 XIAO Chun-ling2

1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Key Lab of Environmental Pollution and Microecology，Shenyang Medical College in Liaoning Province，Shenyang 110034，China

[Abstract]Objective To develop a new method for easy rat and mouse alveolar lavage.Methods Mouse stomach needle and electrophoresis point sample suction head applied to develop a new alveolar lavage operation system in rat and mouse.Sterile syringe of 10 ml or 1 ml was used respectively to complete the alveolar lavage with the intubation tool.Ten male Wistar rats （weight was 220-250 g） and ten male CB17-SCID mice （weight was 24-28 g） were performed for intubation and alveolar lavage fluid collection.Results 20 times of intubation and alveolar lavage operation were completed.1×107 alveolar macrophages from rat and 3×106 alveolar macrophages from mouse were successfully collected.Conclusion A new method of alveolar lavage in rat and mouse set up applying mouse stomach needle and point sample suction head can be widely used in the study of respiratory disease model in rat and mouse.

隨着呼吸系统相关疾病研讨的深化，运用肺泡灌洗液中成分的改变及其在疾病中的含义，对研讨各种因素所引发的肺相关疾病具有重要价值[1-2]。许多试验室对大、小鼠肺泡灌洗办法不断的进行改造[3-9]，随之而来的许多成功有用的技能手段得到广泛的运用。为了本课题组展开进一步科学研讨的需求，本研讨树立了运用惯例试验器件树立大、小鼠肺泡灌洗的新办法，这种办法的运用和推行将从经济层面和技能层面协助到更多试验室的科研人员。本研讨扼要描绘详细的操作办法和关键，等待与广阔研讨者进行讨论和学习。

1 资料与办法

1.1 试验资料

动物：10只Wistar大鼠[体重220～250 g，许可证号：SCXK （京） 2012-0001]和10只雄性CB17-SCID小鼠[体重24～28 g，许可证号：SCXK （京） 2012-0001]购于北京维通利华动物试验动物技能有限公司，惯例养殖于辽宁中医药大学试验动物中心SPF级动物房内，12 h/12 h昼夜光照，动物房温度为22～24℃，湿度为70%。

资料：乙醚（国药集团化学试剂有限公司）、小鼠灌胃针（12#，6 cm）、1～200 μl Pipette Tip （Thermo Fisher，Cat.# 010-Q）、PBS（Ca2+，Mg2+ Free，Hyclone，GE）、血细胞计数板、1#手术线、Leica AM6000显微镜、1640培育基、四季青胎牛血清及1 ml和10 ml无菌注射器（镇江康利医疗器械有限公司）。

1.2 操作办法

1.2.1 大鼠肺泡灌洗操作办法 试验预备：首要对小鼠灌胃针等用具进行灭菌。在50 ml离心管底部填充约5 ml体积的棉球，然后用吸管向棉球内部添加3 ml乙醚液体，假如需求添加大鼠麻醉数量，当令弥补乙醚的运用剂量。对Wistar大鼠进行麻醉处理，调查大鼠的呼吸频率，待呼吸由短促转慢时，将其固定于鼠板上，此刻假如大鼠复苏，重复进行麻醉。将大鼠处死（大鼠腹主动脉法采血），然后喷洒适量75%乙醇，在无菌条件下进行支气管肺泡灌洗术。

肺泡灌洗操作：①沿正中线剪开腹部和颈部皮肤，别离大鼠肺和气管安排。将气管和肺安排置于直径100 mm培育皿中，先将1#手术线打结放在间隔气管切断端5 mm左右方位，然后将经过灭菌处理的小鼠灌胃针刺进到大鼠气管中，一起用力系紧之前在近气管切断端的打结（图1）。取注射器抽取预冷的不含钙镁离子的PBS缓冲液5 ml注入肺腔，悄悄按摩肺脏，逗留20 s后再缓慢回抽支气管肺泡灌洗液。以上操作重复10次，25～40 ml液体。② 置于4℃离心机以1000 r/min，离心10 min，后弃上清液。③ 10%小牛血清的RPMI1640细胞培育液悬浮细胞，经过培育后，贴壁成长的大鼠肺泡巨噬细胞能够进行下一步的试验研讨。

1.2.2 小鼠肺泡灌洗操作办法 试验预备：首要进行插管用具处理，即用剪刀减掉吸头结尾约5 mm，在试验操作之前完结Thermo吸头与1 ml注射器的符合要求，留意一定要符合杰出（假如剪刀剪去的长度不合适，会使吸头与注射器的符合性差，灌洗时发作漏液）。处理好吸头后，与其他试验用具一起灭菌。CB17-SCID鼠处死（小鼠摘眼球法搜集外周血），固定鼠板后喷洒适量75%乙醇，在无菌条件下进行支气管肺泡灌洗术。

肺泡灌洗操作：①沿正中线剪开腹部和颈部皮肤，别离小鼠肺和气管安排。将气管和肺安排置于直径60 mm培育皿中，先将1#手术线打结放在在气管切断端5 mm左右方位，然后将经过剪切及灭菌处理的吸头刺进到小鼠气管中，一起用力系紧之前在近气管切断端的打结（图2）。取注射器抽取预冷的不含钙镁离子的PBS缓冲液1 ml注入肺腔，悄悄按摩肺脏，逗留20 s后再缓慢回抽支气管肺泡灌洗液。以上操作重复10次，5～8 ml液体。②置于4℃离心机以1000 r/min，离心10 min，后弃上清液。③10%小牛血清的RPMI1640细胞培育液悬浮细胞，经过培育后，贴壁成长的小鼠肺泡巨噬细胞能够进行下一步的试验研讨。

2成果

依托小鼠灌胃针和电泳点样吸头树立的大、小鼠肺泡灌洗新办法共完结20次插管和肺泡灌洗操作，搜集的肺泡巨噬细胞，用10%小牛血清的RPMI1640细胞培育，经过细胞计数能够得到约1×107个大鼠肺泡巨噬细胞，细胞形状特征如图3所示； 经过计数能够得到约3×106个小鼠肺泡巨噬细胞，形状特征如图4所示。经过贴壁挑选及图画搜集证明取得的细胞为高质量的肺泡巨噬细胞，提示试验技能办法有用，立异搜集肺泡灌洗液的办法成功。

3討论

近年呼吸系统疾病的研讨呈上升趋势，支气管肺泡灌洗技能已越来越多地运用于外源性化合物对肺脏毒性效果的研讨，经过对支气管肺泡灌洗液（ bronchalveolar lavage fluid， BALF）中细胞、生化、肺表面活性物质等多种成分的剖析，能够讨论化合物对肺脏的效果机制[10-12]。BALF中一些酶类的改变能够直接反映肺安排细胞的氧化损害状况。获取的肺泡巨噬细胞直接露出于引发呼吸系统炎性疾病的各种因子中，而这些成分激活的肺泡巨噬细胞能够排泄多种细胞因子和趋化因子并激活其他效应细胞，乃至损坏肺部安排结构[13-14，2]。运用惯例试验室耗材树立的大、小鼠肺泡灌洗新办法已经成为呼吸系统损害机制研讨的必要技能。

运用惯例试验室耗材树立的大、小鼠肺泡灌洗新办法具有以下长处：①将气管和肺安排剪切下来，可视性更好，能够愈加直观地完结灌洗操作；②运用小鼠灌胃针完结大鼠肺泡灌洗操作，首要，能够更好地防止试验用具给安排带来的损害，别的，还能够防止结扎后安排和灌胃针脱离的发作；③运用处理后于1 ml注射器相符合的点样吸头，由于吸头一端到另一端逐步变细，所以能够与小鼠气管触摸得更严密，防止漏液的发作，一起也能够防止运用金属锐器完结灌洗形成的安排损坏。

操作的留意事项：①灌洗前搜集血样时，大鼠腹主动脉采血量应>6 ml；小鼠摘眼球采血量应>0.5 ml；假如搜集的血量太少，则需求参加适量的红细胞裂解液，消除红细胞对研讨带来的影响；依照上述要求完结的肺泡灌洗液搜集的细胞经过培育后，经过替换培育基，即能够除掉未贴壁成长的红细胞。②别离大、小鼠气管和肺安排时，切勿剪破肺安排，形成灌洗操作无法完结，并且小鼠气管的剪切要尽量接近其口咽部，确保气管长度满足经过吸头完结肺泡灌洗液的搜集。③进行灌洗时，留意灌胃针和吸头的推动视点及注射器推入液体的速度，推动视点太大简单形成气管安排破损，液体推入的速度太快简单漏液。④抽取灌洗液时，要由气管一端到另一端变换方位完结，一般来说，能够由近支气管端向远端进行，由于气管有1/3左右的纤维结缔安排的特别安排结构，所以抽取液体时结缔安排会堵塞吸头，需求改变方位完结。⑤进行肺泡灌洗操作时，要逐个完结，如一起搜集多组气管和肺安排，可由多人完结肺泡灌洗液操作，否则会影响取得肺泡巨噬细胞的质量。

综上所述，经过小鼠灌胃针和电泳点样吸头树立的大、小鼠肺泡灌洗新办法，斗胆地改善和立异了肺泡灌洗办法的试验操作，运用惯例试验室耗材树立的大、小鼠肺泡灌洗新办法操作简练，可重复性好，能够广泛用于大、小鼠肺泡灌洗液的搜集。娴熟此种技能能够更好地为科学研讨效劳。

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