抗肝癌的12种食物：Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达

刘鼎++++++刘建生

[摘要] 意图 检测Rab27A与Rab27B在3种人肝癌细胞系及1种永生化肝细胞系中的表达状况，开始研讨Rab27A与Rab27B表达对肝癌细胞生物学特性的影响。 办法 选用RT-PCR及Western blot技能，检测Rab27A与Rab27B mRNA在3种人肝癌癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702中的表达。 成果 Rab27A与Rab27B在肝癌细胞系及原发性肝癌安排中存在差异性表达。Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达显着强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均显着表达但无显着差异。 定论 Rab27A与Rab27B与原发性肝癌密切相关，能够为临床采纳合理确诊办法供给有用的参阅根据。

[关键词] Rab27A；Rab27B；肝细胞癌；RT-PCR；Western blot

[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（a）-0004-04

Expression of Rab27A and Rab27B in the four different hepatocellular carcinoma

LIU Ding LIU Jian-sheng▲

The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract] Objective To investigate the expression of Rab27A and Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line and its effect on biology characteristics of the cells. Methods The mRNA expression of Rab27A and Rab27B was detected by RT-PCR，and Western-blot in 3 human HCC lines of HepG2，Huh-7，Li-7 and the immortalized hepatic cell line of HL-7702. Results Rab27A and Rab27B were differentially expressed in cell lines and primary HCC tumors.The expression of Rab27A in 3 human HCC line was significantly better than that expressed in the immortalized hepatic cell line；the mRNA of Rab27B in 3 human HCC lines and the immortalized hepatic cell line were significantly expression but there was no significantly difference. Conclusion Rab27A and Rab27B expression are closely correlated HCC，it can provide the clinical reasonable diagnostic measures as valuable effective reference basis.

[Key words] Rab27A；Rab27B；Hepatocellular carcinoma；RT-PCR；Western blot

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，具有极高的侵袭性和搬运性，呈现典型症状时，往往现已为晚期。现在与HCC发展相关的因子包含癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA199）、反常凝血酶原（DCP）等，一起Rab宗族被证明与肿瘤密切相关。本文选用RT-PCR及Western blot技能检测了Rab27A与Rab27B在3种人肝癌细胞系及1种永生化肝细胞系中的表达状况，以期进一步研讨其对肝癌细胞生物学特性的影响，为原发性肝癌的研讨供给理论基础。

1 材料与办法

1.1 材料和仪器

3种人肝癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702均采购自我国科学院上海生科院细胞资源中心，并依照其主张的办法进行培育。20%胎牛血清、RPMI 1640培育基、DMEM高糖培育液购自GIBCO公司，DEPC购自Sigma公司，ECL显色试剂盒购自Thermo-fisher公司，NC膜购自Amersham公司，引物、Rab27A兔多抗、Rab27B羊多抗、HRP符号驴抗兔IgG、β-actin购自生工生物工程公司，Trizol、Taq PCR试剂盒购自TaKara公司，PCR反响仪选用Thermocycler（Biometra Germany公司），Alphaimager 2200剖析仪（Alpha Innotech，San Leandro，CA公司），其他惯例化学试剂均为剖析纯。

1.2 办法

1.2.1 细胞培育 各种细胞均依照规范办法进行培育，传代时用2.5 g/L的胰蛋白酶消化， 按1∶3的份额传代。取成长状况杰出、密度80%～90%的细胞用于试验。

1.2.2 RT-PCR Rab27A基因引物F：5′-AACCGCCACAGTCTTCAATC-3′，R：5′-TCCCTGACCCTTCAAT-CAAC-3′；Rab27B基因引物F：5′-CCCTAAAAATCCCAGTCCATC-3′，R：5′-GAGCATCCCAGAGGAAACAC-3′。反响进程如下：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，最终72℃终延伸5 min，β-actin作为内参，扩增30个循环。PCR反响产品行1%琼脂糖凝胶电泳，选用凝胶成像系统剖析成果。随后对细胞系中的Rab27A与Rab27B mRNA的表达水平进行全定量PCR。

1.2.3 Western blot SDS-PAGE别离蛋白，每个样品的上样量为50 μg，电转至NC膜。5%脱脂牛奶4℃关闭1 h，孵育一抗Rab27A（1∶1000稀释）或Rab27B（1∶1200稀释），4℃过夜。倒掉一抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10 min。参加相应种属的辣根过氧化物酶符号的二抗溶液（1∶10 000稀释），摇床上缓慢摇摆，37℃ 2 h。倒掉二抗溶液，用TBST漂洗液滤膜3次，每次10 min。最终选用ECL试剂盒显影，定影，调查杂交信号。

1.3计算学办法

选用SPSS 17.0计算软件进行数据处理，计数材料以率标明，选用χ2查验。以P < 0.05为差异有计算学含义。

2 成果

经过选用RT-PCR、Western blot剖析了3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中Rab27A及Rab27B mRNA及蛋白表达状况。β-actin内参条带在205 bp处皆闪现亮堂且无显着差异，Rab27A mRNA在357 bp处3种人肝癌细胞系中显着亮于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在302 bp处均呈现意图条带，且条带明晰；试验重复3次。成果标明Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达显着强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均显着表达但无显着差异（图1）。其间，β-actin作为内参。

A

3 评论

HCC是一种严重威胁人类生命的恶性肿瘤，发生率位居全球恶性肿瘤发病率第5位，逝世率位居全球恶性肿瘤发病率第3位，全球每年死于HCC患者人数高达69.6万，其间超越50%的肝癌新发患者与逝世患者来自我国[1-2]。HCC的侵袭和搬运进程涉及到肿瘤细胞的增殖、黏附、搬迁和侵袭等进程，而这一进程正是经过多种因子间的彼此协调来完成。2013年诺贝尔生理学和医学奖赞誉詹姆斯·罗思曼等人发现细胞的囊泡运送调控机制，标明细胞膜的割裂与囊泡运送时细胞膜裂解是一起的。细胞的生命活动依赖于细胞内运送系统的精细结构和操控结构，经过与方针细胞膜交融，在神经细胞指令下可准确操控激素、生物酶、神经递质等分子传递的恰当时刻与方位。RabGTP酶类作为机体内一组与内膜运送相关的调理蛋白，能够作为囊泡运送的分子开关，与GTP结合则有活性，与GDP结合则无活性，经过与上游调控因子和下流特异效应因子彼此效果，影响细胞的排泄、胞吞、信号转导及发育，并能够操控膜结构的一起性和囊泡的构成、转运、黏附、锚定、交融等进程，然后发挥重要的效果[3-4]。

人类Rab蛋白广泛散布于各种生物细胞内不同的膜结构上，是小分子GTP结合蛋白宗族中最大的亚宗族，包含超越60个成员组成，能够经过不同的可变剪切方式而发生各种功用特异的亚型[5-6]。Rab宗族能够经过特异性地定坐落胞质中某些亚细胞器然后发挥特别的功用，而按捺其间一些蛋白的表达，细胞膜的裂解次数可显着削减[7]。Rab27亚宗族包含Rab27A与Rab27B，两者是具有71%同源性的小GTP 酶（20～29 kD），能够经过影响囊泡运送物质来按捺机体免疫监视功用，并为肿瘤细胞供给抱负的生存环境，促进血管生成及肿瘤细胞增殖搬运[8]。Rab27A在人类染色体位点15q15-21.1，调理因子有3种：Rab亲和蛋白，Slac2和Muncl3-4，功用主要为特异性地调理囊泡出胞进程，促进囊泡与细胞膜交融，而且激活溶酶体，促进细胞膜裂解[9]。Rab27A参加细胞色素颗粒的转运，若表达缺失会导致色素冷静消失和黑素小体转运功用缺点，然后导致一种稀有的常染色体隐性遗传性疾病——格里塞利综合征（GS）[10-11]。Rab27A经过与Melanophilin和肌浆球蛋白Ⅴa一起构成一个三元复合体，参加粗细肌丝的滑行运动，因而有学者认为Rab27A具有肌球蛋白受体的悉数或部分功用[12]。研讨标明Rab27A能够经过调理VEGF、cyclin D1、IGF-2、MMP-9、MMP-7和p16蛋白的表达，然后在肿瘤细胞体内增殖、侵袭和搬运中发挥促进效果[13]。Rab27B坐落18号染色体上，调理因子有3种：杰出结合蛋白4（Slp4），Slac2b和Noc2，功用主要为参加大多数排泄性细胞的胞吐效果及运送进程，促进囊泡物质由细胞质向细胞膜区域运动，在脑垂体、腮腺腺泡细胞、胰腺腺泡细胞的胞吐效果及血小板细密中心颗粒的排泄中有重要的调理效果[14-16]。有研讨标明，按捺uPA和HGF的胞外水平的表达，HCC的侵袭和搬运才能均显着下降。

近来研讨发现，Rab27A与乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、神经胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞的侵袭和搬运密切相关；Rab27B表达于乳腺、肝脏、胃、大肠、脾、眼、心脏、肾脏等多种肿瘤细胞[16-20]。本试验选用RT-PCR及Western blot技能，检测Rab27A与Rab27B mRNA在3种人肝癌细胞HepG2、Huh-7、Li-7及1种永生化肝细胞系HL-7702中的表达，笔者发现，Rab27A与Rab27B在肝癌细胞系及原发性肝癌安排中存在差异性表达，Rab27A mRNA在3种人肝癌细胞系中表达显着强于1种人永生化肝细胞系；Rab27B mRNA在3种人肝癌及1种人永生化肝细胞系中均显着表达但无显着不同。因而，根据上述试验成果，Rab27A与Rab27B与HCC密切相关，能够为临床采纳合理确诊办法供给有用的参阅根据。

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（收稿日期：2015-01-30 本文修改：卫 轲）