mgmt发动子甲基化：骨关节炎患者关节软骨TIMP—3发动子区甲基化水平的开始研讨

彭红春　谢明　沈奕　彭丹

[摘要] 意图 评论关节软骨中安排金属蛋白酶按捺因子-3（TIMP-3）基因发动子区甲基化与其蛋白表达的相关性，并剖析TIMP-3基因CpG岛反常甲基化与骨关节炎（OA）的关联性。 办法 使用甲基化特异性的聚合酶链反响（MSP）技能和免疫安排化学SP法别离检测14例健康人的正常关节软骨细胞和35例骨关节炎（OA）患者软骨细胞TIMP-3基因发动子区甲基化和蛋白表达状况。 成果 OA患者和健康人关节软骨中TIMP-3基因发动子区均有甲基化润饰，其阳性率别离为74.3%（26/35）和35.7%（5/14），OA组TIMP-3基因发动子区甲基化率显着高于健康组（P<0.05）。14例健康人中，软骨细胞TIMP-3蛋白表达阳性10例（71.4%），而35例OA患者中，软骨细胞TIMP-3蛋白表达阳性11例（31.4%）。24例OA患者软骨细胞蛋白表达阴性的标本中，TIMP-3发动子区甲基化阳性21例（87.5%）；26例TIMP-3发动子区甲基化阳性的标本中，蛋白表达阴性21例（80.8%），TIMP-3发动子区甲基化与蛋白表达呈显着负相关（P<0.05）。 定论 发动子区CpG岛高甲基化是OA患者关节软骨细胞TIMP-3表达失活的首要机制之一，其可能参加了OA的发作和开展。

[关键词] 骨关节炎；甲基化；TIMP-3发动子；CpG岛

[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）01（b）-0004-04

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨退变和关节周围骨质增生为病理特征的缓慢进行性骨关节疾病，其发病机制尚不清楚[1]。有研讨以为OA软骨的损坏可能与关节软骨细胞排泄细胞外基质（ECM）降解酶（如胶原酶和蛋白聚糖酶），然后导致ECM降解添加和（或）ECM组成削减有关；而金属蛋白酶按捺剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是这些酶的天然按捺剂[2]。TIMP-3为TIMPs宗族中的一个特别成员，在OA患者和正常人软骨细胞中均有表达。TIMP-3能按捺胶原酶和蛋白聚糖酶对ECM的降解，并促进ECM组成[3]。TIMP-3还能下调IL-1、TNF-α、IL-6表达，削减其对骨关节软骨的损坏[4]。研讨发现TIMP-3基因敲除小鼠患骨关节炎的易理性添加，而发动子区甲基化可能是 TIMP-3基因失活的机制[5]。笔者选用亚硫酸氢钠测序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）检测关节软骨细胞中 TIMP-3基因发动子区甲基化状况，选用免疫安排化学SP办法检测关节软骨细胞中TIMP-3蛋白的表达状况，以评论TIMP-3基因在OA发作开展中的效果以及其失活机制。

1 材料与办法

1.1 材料

14例正常膝关节软骨安排取自2011年9月～2012年10月年因交通事故在中南大学湘雅二医院行大腿中下段截肢的患者，男性8例，女人6例，年纪19～60岁，均匀40岁。30例OA膝关节软骨安排取自2011年9月～2012年10月年在中南大学湘雅二医院就诊，依据1995年美国风湿协会骨关节炎的确诊规范确诊为OA且有膝关节置换手术指征的患者，男16例，女19 例，均匀年纪65岁。术中无菌收集标本，每组标本分为2份：1份白腊包埋，进行免疫组化检测；另1份放液氮罐内保存，以行分子生物学剖析。

1.2 亚硫酸氢钠测序

取约50 mg安排，经EDTA脱钙液脱钙后，参加安排裂解液进行匀浆，匀浆经蛋白酶K消化，用心吸附柱法提取软骨安排DNA，外分光光度计检测DNA纯度和浓度，4℃保存备用，用琼脂糖电泳法判定DNA完好性。取30 μl DNA水溶液用EZ DNA Methylation-Gold KitTM DNA甲基化试剂盒（北京天漠公司）进行纯化和润饰。处理好的DNA放入-70℃冰箱保存。

选用Methyl Primer Express V1.0软件（ABI公司）规划TIMP-3基因发动子区甲基化引物序列，并由上海英骏生物工程技能服务有限公司组成。TIMP-3甲基化上游引物序列为5′-CGTTTCGTTATTTTTT-GTTTTCGGTTTC-3′，下流引物序列为5′-CCGAAA-ACCCCGCCTCG-3′（116 bp），TIMP-3非甲基化上游引物序列为5′-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3′，下流引物序列为5′-CCCCCAAAAACCCCACCTCA-3′（122 bp）。PCR总反响系统20 μl：模板DNA为2 μl，Taq 酶10 μl，上游及下流引物各0.8 μl，加ddH2O至总体积20 μl。取10 μl PCR 扩增产品上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳60 min（电压100 V），溴乙锭染色，紫外灯下检测扩增产品，数码相机摄片保存，PCR产品 4℃保存备用。

1.3免疫安排化学检测

白腊包埋安排标本，5 μm接连切片。选用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶SP法检测， 切片惯例脱蜡处理后，置于抗原修正液中95℃ 10～15 min进行修正，其他进程参照说明书进行。切片经梯度乙醇脱水、枯燥，二甲苯通明，中性树胶封固后，在显微镜下调查并摄影。

1.4 统计学办法

选用SPSS 17.0统计学软件，计数材料数据选用百分率标明，各组间率的比较选用χ2查验、Fisher 切当概率法查验和Spearman等级相关剖析。

2 成果

2.1 DNA完好性检测

提取的基因组DNA经2%琼脂糖凝胶电泳，DNA片段显着大于1000 bp，DNA完好，无降解（图1）。

图1 琼脂糖凝胶电泳中的DNA片段

2.2 两组关节软骨细胞TIMP-3发动子区甲基化状况比较

以不加DNA标本为空白对照组，其间OA患者与健康人软骨中TIMP-3发动子区甲基化阳性率别离为74.3%（26/35）和35.7%（5/14），两组差异有统计学含义（χ2=6.402，P=0.0114）（图2，表1）。

图2 琼脂糖凝胶电泳法显现的健康组及OA组关节软骨中

TIMP-3发动子区甲基化状况

M.TIMP-3甲基化引物扩增后的产品（116 bp）；U.TIMP-3非甲基化引物扩增后的产品（122 bp）；A.OA组关节软骨细胞； B.健康组关节软骨细胞；C.空白对照

表1 OA组和健康组关节软骨中TIMP-3发动子区甲基化水平

2.3 两组关节软骨细胞TIMP-3蛋白表达状况

TIMP-3蛋白表达阳性表现为胞质或核膜呈现棕黄色染色，经剖析健康人和OA患者膝关节软骨细胞TIMP-3蛋白阳性率别离是71.4%（10/14）和31.4%（11/35），两组差异有统计学含义（χ2=6.533，P=0.0106）（图3，表2）。

A B C

图3 TIMP-3蛋白在骨关节炎患者软骨中的表达（SP×200）

A.阴性（胞质或核膜呈现蓝色染色）；B.阳性（胞质或核膜呈现棕黄色染色）；C.健康组阳性（胞质或核膜呈现棕黄色染色）

表2 健康组和OA组关节软骨细胞中TIMP-3蛋白表达状况

2.4 OA患者软骨细胞TIMP-3发动子区甲基化状况与蛋白表达的联系

26例TIMP-3发动子区甲基化阳性的OA患者中，21例TIMP-3蛋白表达阴性（80.8%）；而24例TIMP-3蛋白表达阴性的OA患者中，21例TIMP-3发动子甲基化阳性（87.5%）。Spearman等级相关剖析标明TIMP-3发动子甲基化与蛋白表达呈显着负相关（rs=-0.447，P=0.000）（表3）。

表3 OA患者软骨细胞TIMP-3发动子甲基化状况与蛋白表达的联系

3 评论

骨关节炎的病理表现为关节软骨进行性损坏和关节周围骨赘构成，考虑可能与关节软骨细胞外基质的分化与组成代谢失衡有关[6]。已有研讨证明基质金属蛋白酶（MMPs）对关节软骨细胞外基质的损害是OA发病机制之一。TIMPs是MMPs的特异性按捺剂，TIMPs与MMPs之间的平衡对机体内细胞的搬迁和ECM重建起关键效果，平衡一旦遭到损坏，将导致一系列病理进程的发作[7]。TIMP-3是TIMPs宗族中仅有存在于ECM中的非溶性蛋白质，与ECM紧密结合，防止ECM受金属蛋白酶及蛋白聚糖酶的降解。

在骨关节炎中，IL-1、IL-6、TNF-α等炎症介质使骨关节软骨中MMPs水平升高，然后使骨关节软骨外周基质损坏添加[4，8]。而当TIMP-3水平升高时，能负反馈调理其对软骨外周基质的损坏效果。因为OA是随年纪添加的退行性病变，从胚胎发育到成年，骨与关节安排中TIMP-3发动子活性逐步下降[9]。此外，Mahmoodi等[5]研讨发现在TIMP-3基因敲除小鼠中，TIMP-3表达缺失可添加小鼠骨关节炎的易理性。相同Zreiqat 等[10]研讨标明，在OA中晚期，骨关节软骨安排中TIMP-3水平显着下降。本研讨也发现与正常患者比较，OA患者骨关节软骨安排中TIMP-3蛋白表达较低。这与Zreiqat 等[10]的研讨成果共同。因而，笔者估测TIMP-3蛋白表达下降或活性损失可能是OA的发病机制之一。但是，在OA发病进程中，TIMP-3表达下降的原因尚不清楚。

DNA甲基化一般发作在CpG位点的C上，其能使某些基因的活性损失[11]。多研讨标明在肿瘤安排中存在TIMP-3发动子区甲基化，其可导致TIMP-3基因表达下降和缺失。TIMP-3基因发动子区甲基化水平随年纪添加而升高[9，12]。因而，笔者估测OA患者骨与关节安排TIMP-3表达下降，可能与基因发动子区甲基化水平升高有关。本研讨发现OA患者和健康人软骨细胞TIMP-3发动子区甲基化阳性率别离为74.3%（26/35）和35.7%（5/14），提示OA患者TIMP-3呈高甲基化状况。除此之外，TIMP-3蛋白表达阴性的OA患者其TIMP-3发动子区甲基化阳性，而某些TIMP-3发动子区甲基化阳性的标本无蛋白表达，进一步统计剖析标明基因发动子区甲基化与蛋白表达呈显着负相关。因而，笔者以为TIMP-3甲基化可能与OA开展进程中TIMP-3蛋白表达下降有关。

TIMP-3发动子区反常甲基化时，转录激活复合物呈涣散状况，无法效果于DNA，然后转录失活和TIMP-3蛋白表达受限；当TIMP-3对金属蛋白酶及蛋白聚糖酶的按捺效果削弱或消失后，炎性因子IL-1、TNFα及IL-6对软骨的损坏效果也削弱或消失，然后软骨外周基质降解添加，终究导致OA的发作和开展。

[参考文献]

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（收稿日期：2013-08-02 本文修改：魏玉坡）

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（收稿日期：2013-08-02 本文修改：魏玉坡）

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（收稿日期：2013-08-02 本文修改：魏玉坡）