D-半乳糖 抗氧化复合酶对D—半乳糖变老模型小鼠的抗变老效果

魏洁　胡刚　侯凤贤　甄永占　林雅军

[摘要]意图 讨论抗氧化复合酶对D-半乳糖变老模型小鼠的抗变老效果。办法 将40只小鼠机分为4组：正常组、变老模型组、低和高剂量复合酶组。除正常组外，小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），给药组别离饮用相应剂量的复合酶溶液，其他组自在饮水，接连8周。检测小鼠血清和肾安排超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性以及丙二醛（MDA）的含量；调查小鼠肾安排结构改动；检测变老相关蛋白表达水平改动。成果 复合酶对小鼠体重没有影响。复合酶可以下降变老模型引起的血糖和胆固醇升高（P<0.05）。与正常组比较，变老模型组小鼠血清和肾安排SOD和GSH-Px活性下降，MDA含量添加（P<0.05）；与变老模型组比较，复合酶可以明显添加血清和肾安排SOD和GSH-Px活性，下降MDA含量（P<0.05）。复合酶可以减轻变老模型小鼠肾安排损害和调控变老相关蛋白的表达。定论 复合酶可以进步活性氧自在基的铲除率，减轻机体损害，推迟变老。

[关键词]复合酶；D-半乳糖；抗氧化；肾安排；变老

[中图分类号]R965.1 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）02-14-05

50多年前Harman提出了变老的自在基理论，他以为变老是自在基对细胞成分和结缔安排损害的成果。这些自在基来自氧化酶催化的分子氧相关反响。自在基铲除剂可直接或直接铲除体内过多的自在基，有用阻挠或避免因为过多自在基而导致的氧化损害，起到维护机体推迟变老的效果。因而，开发与研讨抗氧化剂具有重要的含义。正常机体中存在针对R0s介导细胞损害的抗氧化防护体系，包含超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）。其间超氧化物歧化酶（SOD）在机体抗氧化体系中扮演着重要人物，其可以将细胞内超氧阴离子（O-）还原成HO。接下来谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）把H2O，代谢成O2和H2O。在病理条件下，如D-半乳糖变老模型，机体的抗氧化才能会下降。因而有必要弥补抗氧化酶或运用氧自在基铲除剂。复合酶是辽宁未来生物科技有限公司选用具有国际先进水平的关闭式生物萃取技能，从玉米胚芽中提取SOD、GSH-Px和CAT三种主要成分研发而成。每100克玉米胚芽提取物含有SOD 378800u、GSH-Px 288000u和CAT17800u。本试验在D-半乳糖变老模型小鼠体内调查了复合酶的抗变老效果。

1.资料与办法

1.1动物

ICR系老练小白鼠，体重（20.0±2.0）g，男女参半，北京维通利华动物中心供给，合格证：SCXX（京）2002-0003。

1.2药物与试剂

复合酶由辽宁未来生物科技有限公司供给；D-半乳糖、H&E染色试剂盒和RIPA安排裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯检测试剂盒由北京瑞正善达生物工程技能有限公司供给；SOD、GSH-Px和MDA试剂盒由南京建成生物工程研讨所供给；10%水合氯醛北京医院制剂室供给；蛋白酶抑制剂套装购自sigma公司。抗SIRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin抗体购自细胞信号通路公司。

1.3试验仪器

酶标仪（SpectraMax 190）由美国MolecularDevices公司出产。奥林巴斯显微镜CK40由日本奥林巴斯公司出产。日立7100型全自动生化剖析仪由日本日立公司出产。凝胶成像仪购自美国alpha公司。

1.4办法

1.4.1动物分组、造模和用药 将40只小鼠按体重随机分为4组（每组10只）：正常组、变老模型组、低剂量复合酶组[13g/（kg·d）]和高剂量复合酶组[26g/（kg·d）]。除正常组外，其他各组小鼠每天背部皮下注射D-半乳糖100mg/（kg·d），继续8周，正常组小鼠每天皮下注射等量的生理盐水，低、高剂量复合酶组别离饮用40mg/mL和80mg/mL的复合酶饮料（假定20g小鼠每天饮水6mL，计算的饮猜中复合酶浓度）。正常组和变老模型组自在饮水，接连8周。

1.4.2调查试验期间动物行为、饮食、饮水改动 每2周调查小鼠体重改动；试验结束时，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔静脉采血，搜集血清。检测血清葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、总胆固醇（CHOD-PAP法）和甘油三酯（GPO-PAP法）含量。

1.4.3SOD、GSH和MDA含量检测 试验结束时，用10%水合氯醛麻醉小鼠，下腔静脉采血，搜集血清。处死小鼠，取肾安排，制备肾安排匀浆后搜集上清液，黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性、二硫代二硝基苯甲酸直接法检测GSH-Px活性、硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

1.4.4小鼠肾安排形态学调查 取各组小鼠的肾脏标本，经10%中性福尔马林溶液固定后，惯例白腊包埋，制作成4um白腊切片，别离进行苏木素一伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H&E），调查肾安排学改动。

1.4.5Western blot检测蛋白表达水平 每组各取50mg-80℃冻存的小鼠肾安排标本，置于RIPA+sigma公司蛋白酶抑制剂中裂解，冰浴下匀浆，离心，取上清液BCA法测定蛋白浓度后制成蛋白含量持平的样品，每孔上样25uL，进行SDS-PAGE电泳。经300mA湿转3h后将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉关闭2h，然后滴加SIRTl、FOX03a、p53、p21和B-actin一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜3遍，二抗室温孵育1h，TBST洗膜3遍，膜上滴加化学发光增强剂（Santa Cruz Biotechnology SC-2048），依照试剂阐明进行操作，成果在凝胶成像仪上照相。

1.5统计学剖析